楊敬坡，王文軍，郭延凱，陳曉軒，都澤銘

(1. 河北科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018; 2. 河北省污染防治生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050018;3. 保定學(xué)院汽車與電子工程學(xué)院，河北 保定 071051)

0 引 言

菊酯類農(nóng)藥是由天然除蟲菊酯為基礎(chǔ)發(fā)展起來的一類殺蟲劑，屬于廣譜、低毒、高效類的殺蟲劑，是目前農(nóng)業(yè)用量較大的一類農(nóng)藥，現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于防治農(nóng)林、衛(wèi)生等病蟲害。蘋果的栽培過程中，主要通過施用有機(jī)磷和菊酯類農(nóng)藥防治蟲害，據(jù)初步估計(jì)，施入果園的菊酯類農(nóng)藥有80%～90%最終都進(jìn)入土壤，而使果園土壤環(huán)境的潛在污染日趨嚴(yán)重[1-6]。土壤隨著雨水、微生物降解等方式，有一定的凈化作用，但如果進(jìn)入土壤中的菊酯類農(nóng)藥在數(shù)量和速度上超過果園土壤的凈化能力，終將導(dǎo)致果園土壤中農(nóng)藥過量而影響環(huán)境。隨著人們健康意識、環(huán)保意識的增強(qiáng)，環(huán)境問題越來越受到廣泛關(guān)注，且菊酯類農(nóng)藥在人體有一定的蓄積性，部分品種對人體有致畸、致突變的影響[7-9]，因此，準(zhǔn)確測定果園土壤中菊酯類農(nóng)藥殘留量對于指導(dǎo)果園種植中農(nóng)藥的使用具有現(xiàn)實(shí)意義。

目前，用于果園土壤中菊酯類農(nóng)藥檢測的方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-13]等。氣相色譜法配備ECD檢測器，檢出限低，但由于土壤基質(zhì)較為復(fù)雜，假陽性檢出率較高；液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，檢出限偏高，不適用于土壤中微量農(nóng)殘的檢測；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法不僅檢出限低，對于基質(zhì)較為復(fù)雜的土壤，能夠準(zhǔn)確地進(jìn)行定性檢測。土壤樣品的前處理方法主要有固相萃取法、加速溶劑萃取法等，這些方法取代了傳統(tǒng)的耗費(fèi)大量時間和溶劑的普通提取方法；但是通常需要較為繁瑣的提取步驟，且溶劑使用量較大，易造成實(shí)驗(yàn)室和環(huán)境污染。最初應(yīng)用于農(nóng)殘檢測的QuEChERS方法，是一種快速、簡單、高效的樣品前處理方法，但應(yīng)用于土壤樣品農(nóng)殘檢測的報(bào)道不多。本文實(shí)驗(yàn)建立一種利用QuEChERS法進(jìn)行果園土壤中菊酯類農(nóng)藥提取，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀定性定量檢測農(nóng)殘的方法。

1 方法與材料

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀 器

氣相色譜儀：島津GC-2010plus型（日本島津公司）；質(zhì)譜儀：QP2010ultra系統(tǒng)（日本島津公司）；電子天平：XS205 型，0.01 mg（瑞士梅特勒公司）；數(shù)控超聲波清洗機(jī)：SK3300LH型（廣州滬瑞明儀器有限公司）；色譜柱：HP-5MS質(zhì)譜專用毛細(xì)管色譜柱（安捷倫科技有限公司）；高速冷凍離心機(jī)：H2100R型（湘儀離心機(jī)公司）；固相萃取柱：SUPELCO C18 500 mg/6 mL（美國 SUPELCO 公司）；純水儀：Milli-Q（密理博科技有限公司）；渦旋混合器：T25，3 000～18 000 r/min（廣州 IKA 公司）；回旋振蕩器：HY-5A型（金壇市江南儀器廠）。1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、試劑

甲氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、高效氯氟氰菊酯、氯菊酯、氰戊菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液：濃度均為100 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究所；QuEChERS吸附劑：安譜QuEChERS（硫酸鎂、PSA和C18）凈化管和QuECh-ERS(硫酸鎂和乙酸鈉)萃取包；甲醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷、環(huán)己烷：色譜純（德國默克公司）；冰乙酸：分析純（國藥集團(tuán)上海試劑有限公司）。

1.2 儀器參數(shù)設(shè)置

1.2.1 氣相色譜參數(shù)

進(jìn)樣口溫度：260 ℃；進(jìn)樣方式：不分流；載氣：氦氣（純度99.999%以上）；碰撞氣：氬氣（純度99.999% 以上）；柱流量：1.8 mL/min；尾吹：75 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；升溫程序：40 ℃ 保持 1 min，40 ℃ 升溫至 130 ℃，升溫速率 23 ℃/min，130 ℃ 升溫至280 ℃，升溫速率 6 ℃/min。

1.2.2 MS 參數(shù)

離子源：ESI離子源；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；電子能量：75 eV；接口溫度：270 ℃；離子源溫度：240 ℃；溶劑延遲時間：2.5 min。

1.3 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：準(zhǔn)確移取100 μg/mL的甲氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、高效氯氟氰菊酯、氯菊酯、氰戊菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL置于同一個10 mL量瓶中，加適量丙酮溶解，再用丙酮定容，搖勻，即得（甲氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、高效氯氟氰菊酯、氯菊酯、氰戊菊酯的濃度均為 10 μg/mL）。

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液：分別取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量，加丙酮稀釋制成質(zhì)量濃度依次為 0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，50.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，加丙酮定容至刻度，搖勻，即得。

樣品溶液：取有代表性的蘋果種植土壤約200 g，粉碎機(jī)粉碎（或研細(xì)），精密稱取約10 g土壤樣品，置于 25 mL 塑料離心管中，加 9 mL 乙腈、1 mL 冰乙酸，超聲提取 10 min，再渦旋混合約 1 min；加入硫酸鎂、乙酰乙酸提取包，渦旋約1 min，振蕩器振蕩 20 min，然后離心 5 min；取離心后的上層清液約5 mL置于裝有分散固相萃取劑的15 mL離心管中，渦旋約 2 min，然后離心 5 min；取離心后的上層清液約3 mL至刻度試管中，45 ℃氮吹至近干，加1 mL丙酮溶解殘?jiān)瑴u旋 1 min，0.45 μm 濾膜過濾，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 農(nóng)藥前處理方法的選擇

QuEChERS提取方法是2002年開發(fā)出來的一種快速、簡單、廉價、高效、耐用、安全的農(nóng)殘?zhí)崛〉那疤幚矸椒?。土壤樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，其中含有大量有機(jī)物和無機(jī)物等共存雜質(zhì)，因此選擇合適的前處理方法是技術(shù)難點(diǎn)。目前，土壤中農(nóng)藥殘留的提取方法主要有固相萃取法、GPC加濃縮法和快速溶劑萃取法。GPC加濃縮法和快速溶劑萃取法，耗用溶劑較大，儀器成本較高，不利于方法推廣應(yīng)用；實(shí)驗(yàn)比較QuEChERS提取方法和固相萃取方法對于加標(biāo)回收的影響。結(jié)果表明，采用QuEChERS提取方法得到的5種菊酯類農(nóng)藥的回收率更優(yōu)，比較結(jié)果見表1。

2.2 程序升溫條件的優(yōu)化

程序升溫參數(shù)的設(shè)置是影響5種菊酯類農(nóng)藥分離和保障色譜峰型的重要因素。實(shí)驗(yàn)選擇等溫條件，設(shè)置柱溫為200 ℃，5種菊酯類農(nóng)藥在HP-5MS色譜柱上的保留順序依次為：聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、氯菊酯和氰戊菊酯。為使色譜峰峰型良好，選擇冷柱頭進(jìn)樣方式，保持其他條件不變，初始溫度分別設(shè)置 40 ℃、50 ℃、60 ℃。實(shí)驗(yàn)證明，選擇40 ℃時，5種菊酯類農(nóng)藥峰型最好，60 ℃時，色譜峰展寬，峰型最差；升溫速度先選擇高速率23 ℃/min 至 130 ℃，再以低升溫速率 6 ℃/min 升溫至280 ℃，實(shí)現(xiàn)了5種菊酯類農(nóng)藥的良好分離。

表1 前處理方法比較結(jié)果

2.3 萃取劑的選擇

土壤是成分很復(fù)雜的混合物，一般情況下主要含有二氧化硅、各種有機(jī)物、金屬氧化物等化合物和一部分金屬單質(zhì)。5種菊酯類農(nóng)藥在弱極性溶劑丙酮和乙腈中易溶解，實(shí)驗(yàn)比較了丙酮、乙腈、丙酮-冰乙酸和乙腈-冰乙酸等溶劑的提取效果。實(shí)驗(yàn)證明：采用丙酮和乙腈作為提取劑時，5種菊酯類農(nóng)殘回收率偏低，且基質(zhì)干擾較大；采用丙酮-冰乙酸作為提取劑時，5種菊酯類農(nóng)殘回收率在80%～120%之間，但基質(zhì)干擾較大；采用乙腈-冰乙酸作為提取劑時，5種菊酯類農(nóng)殘回收率在80%～120%之間，且基質(zhì)干擾最小。故選擇乙腈-冰乙酸作為萃取劑。

2.4 空白試劑影響研究

實(shí)驗(yàn)按照樣品提取步驟，分別配制試劑空白、試劑加標(biāo)，按1.2實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣分析。過程如下：取25 mL塑料離心管，加9 mL乙腈、1 mL冰乙酸，超聲提取10 min，再渦旋混合約 1 min；在加入硫酸鎂、乙酰乙酸提取包，渦旋約 1 min，振蕩器振蕩 20 min，然后離心5 min；取離心后的上層清液約5 mL置于裝有分散固相萃取劑的15 mL離心管中，渦旋約2 min，然后離心5 min；取離心后的上層清液約3 mL至刻度試管中，45 ℃氮吹至近干，加1 mL丙酮溶解殘?jiān)?，渦旋 1 min，0.45 μm 濾膜過濾，得試劑空白溶液；同法在25 mL塑料離心管中先行加入一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液，后續(xù)按上述配制方式進(jìn)行，得試劑加標(biāo)溶液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，試劑空白無干擾，試劑加標(biāo)回收率在86.3%～95.4%之間。

2.5 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

取甲氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、高效氯氟氰菊酯、氯菊酯、氰戊菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別配制質(zhì)量濃度約為10 μg/mL的單標(biāo)溶液，加丙酮稀釋至刻度，搖勻。5種菊酯類農(nóng)藥分別進(jìn)行Q1Scan（全掃描模式），得到甲氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、高效氯氟氰菊酯、氯菊酯、氰戊菊酯的總離子流圖、保留時間和母離子；然后將各個農(nóng)藥對應(yīng)的母離子進(jìn)行production scan (產(chǎn)物離子掃描模式)，得到5種菊酯類農(nóng)藥的定量離子對和定性離子對；分別對5種菊酯類農(nóng)藥的定量離子和定性離子，進(jìn)行碰撞時間、碰撞電壓等的優(yōu)化。優(yōu)化完畢后，建立5種菊酯類農(nóng)藥的MRM方法（多反應(yīng)監(jiān)測）。典型譜圖如圖1所示。

2.6 線性方程及檢出限

分別取1.3溶液配制項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量，加丙酮稀釋制成質(zhì)量濃度依次為0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，50.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，加丙酮定容至刻度，搖勻；待GC-MS儀器穩(wěn)定后，分別進(jìn)樣上述6個標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到5種菊酯類農(nóng)藥不同濃度點(diǎn)的峰面積，再以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)GB/T32465-2015《化學(xué)分析方法驗(yàn)證確認(rèn)和內(nèi)部質(zhì)量控制要求》，以3倍信噪比計(jì)算檢出限，10倍信噪比計(jì)算定量限。5種菊酯類農(nóng)藥線性范圍、曲線方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表2。

圖1 5種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)總離子流圖

表2 5種菊酯類農(nóng)藥線性范圍、曲線方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.7 方法回收率實(shí)驗(yàn)

取有代表性的蘋果種植土壤約200 g，粉碎機(jī)粉碎（或研細(xì)），精密稱取約10 g土壤樣品，置于25 mL塑料離心管中，分別取1.3溶液配制項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量，加到樣品中（加標(biāo)后濃度依次為：0.1，1.0，10.0 μg/mL），后續(xù)按照 1.3 樣品溶液配制方法進(jìn)行前處理。待儀器穩(wěn)定后，分別進(jìn)樣上述3個濃度的樣品加標(biāo)溶液，計(jì)算加標(biāo)回收率。結(jié)果表明，5種菊酯類農(nóng)藥3個濃度點(diǎn)的加標(biāo)回收率在80.6%～106.7%之間，結(jié)果見表3。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.8 方法重復(fù)性試驗(yàn)

取有代表性的蘋果種植土壤約200 g，粉碎機(jī)粉碎（或研細(xì)），精密稱取約10 g土壤樣品，置于25 mL塑料離心管中，分別取1.3溶液配制項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量，加到樣品中（加標(biāo)后濃度為0.5 μg/mL），后續(xù)按照1.3樣品溶液配制方法進(jìn)行前處理，同法配制6份樣品加標(biāo)溶液。待儀器穩(wěn)定后，6份樣品溶液各進(jìn)樣1針，計(jì)算6次重復(fù)性的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD；取6份樣品中任意一份，連續(xù)進(jìn)樣6次計(jì)算精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。結(jié)果表明，5種菊酯類農(nóng)藥重復(fù)性RSD結(jié)果在3.5%～4.6%之間，精密度RSD結(jié)果在1.8%～2.8%之間，結(jié)果見表4和5。

表4 方法重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表5 方法精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.9 同類方法比較研究

實(shí)驗(yàn)選擇用此方法與現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14550-2003 《土壤中六六六和滴滴涕測定的氣相色譜法》與農(nóng)業(yè)部NY/T 761-2008《蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定》進(jìn)行比較。過程如下：分別在空白土壤中加入一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用本文實(shí)驗(yàn)方法、GB/T14550-2003方法以及NY/T 761-2008進(jìn)行前處理，按1.2實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，采用本實(shí)驗(yàn)方法前處理過程簡單，檢測結(jié)果準(zhǔn)確度較高，比較結(jié)果見表6。

3 結(jié)束語

實(shí)驗(yàn)建立一種利用QuEChERS提取方法對蘋果種植土壤進(jìn)行5種菊酯類農(nóng)藥的提取，采用氣相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行定性定量分析。首先對前處理方法進(jìn)行比較，證明采用QuEChERS提取方法得到農(nóng)藥的回收率更好；優(yōu)化了氣相色譜程序升溫條件；優(yōu)化了萃取溶劑；對質(zhì)譜檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立5種菊酯類農(nóng)藥的MRM（多反應(yīng)監(jiān)測）方法；考察了方法的線性曲線，相關(guān)系數(shù)r2均不低于0.995；檢出限在 0.008～0.02 mg/kg 之間，定量限在 0.03～0.06 mg/kg 之間；3 個濃度點(diǎn)（0.1，1.0，10.0 μg/mL）加標(biāo)回收率在80.6%～106.7%之間；方法重復(fù)性RSD在3.5%～4.6%之間，精密度RSD在1.8%～2.8%之間。結(jié)果表明，本方法具有前處理簡單、快速，檢測準(zhǔn)確度較高，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可以用于蘋果種植土壤中菊酯類農(nóng)藥的檢測，為合理化使用各種菊酯類農(nóng)藥以及種植土壤中菊酯類農(nóng)藥殘留的分析檢測提供技術(shù)依據(jù)。

表6 同類方法比較結(jié)果