胡冰， 吳雪穎， 馬?？?， 萬小平， 肖永樂， 陳建林， 李江淩， 呂學斌*， 王澤洲， 高榮*

(1.四川大學生命科學學院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，四川省動物疫病預防與食品安全重點實驗室，成都610065； 2.四川省畜牧科學研究院，成都610066； 3. 四川省動物疫病控制中心，成都610035)

目前，動物傳染病仍然嚴重阻礙我國畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展。動物飼料中添加的傳統(tǒng)化學藥物和抗生素導致動物病原體耐藥性持續(xù)增長，這仍然是傳染病控制和預防的巨大挑戰(zhàn)(Thorne，2007)。同時，由于免疫機能弱或動物免疫抑制等復雜因素，生產(chǎn)中經(jīng)常出現(xiàn)疫苗免疫應答差、免疫保護率低下，嚴重妨礙了動物感染性疾病的防控(Shinetal.，2013)。因此，急需開發(fā)安全、高效、經(jīng)濟的新型免疫調(diào)節(jié)劑。

許多細胞因子已被用作佐劑，以增強動物疫苗的原發(fā)性和記憶免疫應答(Kayamuroetal.，2010)，對免疫系統(tǒng)有重大的影響，并具有塑造和引導調(diào)節(jié)免疫應答的能力(Plotkin & Plotkin，1999)。白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)參與T細胞增殖和Th調(diào)節(jié)反應，可增強機體的細胞免疫應答、刺激活化的B淋巴細胞增殖并誘導免疫球蛋白分泌(Jensonetal.，2016)，是在調(diào)節(jié)先天性和適應性免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用的細胞因子，可以增強清除細菌和病毒的吞噬反應。

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是大多數(shù)生物機體先天免疫的重要組成部分，在皮膚和黏膜表面發(fā)揮天然免疫作用，并對各種細菌、病毒、真菌和寄生蟲具有抗菌活性(Gordonetal.，2005)。AMPs具有保守的前肽序列，已在幾種哺乳動物中鑒定出(Bals & Wilson，2003)。除了直接抗菌的作用外，AMPs作為炎癥介質(zhì)影響多種過程，如細胞增殖和遷移、免疫調(diào)節(jié)、傷口愈合、血管生成、細胞因子和組胺釋放(Wuerth & Hancock，2011)。因此，AMPs可作為創(chuàng)新藥物的原型處理感染或調(diào)節(jié)免疫反應(Bals & Wilson，2003；Niyonsabaetal.，2009)。

為了開發(fā)新型、經(jīng)濟實用的免疫調(diào)節(jié)劑，本實驗通過2A自剪切技術(shù)構(gòu)建重組酵母菌，共同表達豬IL-2和融合APMs基因，并探索對小鼠的免疫應答和生長的影響。

1 材料和方法

1.1 重組畢赤酵母Pichiapastoris及其構(gòu)建

從重組真核質(zhì)粒VRIL4/6-2中克隆了豬IL-2基因(標記為IL2-2A-a)的cDNA，并從重組VASP質(zhì)粒中克隆出豬融合AMPs基因(標記為2A-a-P)的cDNA。質(zhì)粒VRIL4/6-2和VASP都保存在本實驗室。從質(zhì)粒pGAPZαA(Invitrogen)中克隆含有FMDV 2A肽和α因子基因以保證分泌表達2A-a片段。用TIANGEN的第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應體系為37 ℃孵育60 min，得到總RNA的cDNA后，以cDNA為模板擴增目的片段。實時熒光定量PCR(qPCR)擴增后的產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在cDNA片段中，根據(jù)實驗要求設計不同的N端和C端。然后，通過重疊延伸拼接技術(shù)將cDNA與片段IL2-2A-a、2A-a、2A-a-P結(jié)合，形成完整的IL2-P基因。

將豬融合AMPs基因(P)和IL2-P基因分別克隆到用GAP啟動子控制的pGAPZαA中，通過限制酶消化法將釀酒酵母Saccharomycescerevisiae的N端α-因子作為分泌信號。然后，將重組質(zhì)粒(pGAPZαA-P和pGAPZαA-IL2-P)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌EscherichiacoliDH5α中，并將陽性轉(zhuǎn)化體在含有25 μg·mL-1博來霉素的低鹽培養(yǎng)基(LLB)平板上篩選，通過直接PCR和測序鑒定。

根據(jù)Invitrogen手冊，通過電穿孔將80 μL巴斯德畢赤酵母SMD1168的電感受態(tài)細胞用10 μg(10 μL無菌水)的AVRⅡ-線性化重組質(zhì)粒(pGAPZαA-P或pGAPZαA-IL2-P)或AVRⅡ-線性化pGAPZαA載體轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后，將200 μL轉(zhuǎn)化細胞在1 mL 0 ℃的1 mol·L-1山梨糖醇中孵育，并在含有100 μg·mL-1博萊霉素的YPDS平板上選擇。將通過基因組分析和PCR篩選的陽性轉(zhuǎn)化體置于10 mL試管中培養(yǎng)，其中，3 mL YPD(1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%D-葡萄糖)培養(yǎng)基在250 r·min-1、30 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h，添加20%甘油，儲存于-80 ℃，其陽性轉(zhuǎn)化子分別標記為融合AMPs重組酵母菌(SGP)、IL-2和融合AMPs重組酵母菌(SG2P)、空質(zhì)粒對照酵母菌(SG)。

1.2 SGP和SG2P的免疫生物活性測定

準備發(fā)酵上清液、胰蛋白酶消化的發(fā)酵上清液和胃蛋白酶消化的發(fā)酵上清液(酶終濃度為0.5 mg·mL-1，在37 ℃恒溫水浴中預孵育1 h)，通過細胞計數(shù)法(CCK8法)測定在3種發(fā)酵上清液中表達重組蛋白的免疫生物活性。首先，參考Collins等(1994)的描述，豬淋巴細胞用豆球蛋白A(ConA)培養(yǎng)刺激制備成淋巴母細胞。每份樣品包括50 μL含5×105個淋巴母細胞的細胞懸液和50 μL樣品上清，一式3份，置于37 ℃、5%CO2烘箱中。孵育48 h后，每孔加入10 μL CCK8，在37 ℃、5%CO2烘箱中再孵育2 h。使用酶標儀680(Bio-Rad，USA)在450 nm下測定每個樣品的吸光度。

1.3 抗菌試驗

用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus正常菌株、抗生素抗性大腸桿菌和金黃色葡萄球菌檢測重組蛋白的抗菌活性，菌株由四川大學生命科學學院王紅寧教授提供。在37 ℃將細菌用新鮮的LB培養(yǎng)基稀釋至5.0×105CFU·mL-1。將100 μL細菌懸浮液轉(zhuǎn)移到96孔板中，然后向每個孔中加入100 μL不同稀釋倍數(shù)的重組肽上清液，每個樣品做3次重復；并將含有不同抗生素的相同培養(yǎng)基[氨芐青霉素(Amp)：100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、400 μg·mL-1；卡那霉素(Kana)：100 μg·mL-1、200 μg·mL-1]作為陽性對照加入到孔中。將平板置于37 ℃烘箱中孵育4 h，并通過酶標儀在600 nm測吸光度。

1.4 小鼠實驗

本實驗使用30只健康的21 d雌性ICR小鼠[四川大學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2013-026，使用許可證號：SYXK(川)2013-185]，隨機分為2個處理組(SGP、SG2P)和1個對照組(SG)，每組10只(表1)。準備3種酵母菌株，在100 mL容量瓶中加入30 mL YPD培養(yǎng)基和300 μL博來霉素(100 mg·mL-1)，接種之前保存的重組巴斯德畢赤酵母和空白巴斯德畢赤酵母，每個接種30 μL。然后在培養(yǎng)箱搖床中以30 ℃、250 r·min-1培養(yǎng)24 h，直到OD600約25。3種畢赤酵母菌(SG、SGP、SG2P)均置于上述相同的發(fā)酵條件下培養(yǎng)。

所有小鼠在整個實驗期間均飼喂相同飼料。在實驗的第0、7、14、21、28和35天，采集每只小鼠0.03～0.04 mL EDTA抗凝血液樣品，分析處理組酵母菌對小鼠免疫功能的影響。

表1 動物實驗分組及口服喂養(yǎng)方案Table 1 Grouping and oral feeding scheme of animal experiments

注： 處理組和對照組的OD600約25， 每組小鼠通過管飼法同時給藥4周

Note： The OD600of experimentals and control were about 25， each group of mice was simultaneously given by gavage for 4 weeks

1.5 攻毒試驗

在接種28 d后，為了檢測小鼠對感染的免疫力和保護作用，在實驗室將有毒的大腸桿菌(100 μL/小鼠)和金黃色葡萄球菌(100 μL/小鼠)注射到小鼠腹腔內(nèi)(每種5只)，每24 h監(jiān)測并記錄所有小鼠，直到第7天將所有存活的小鼠安樂死并解剖觀察內(nèi)臟和組織。

1.6 小鼠體質(zhì)量

在接種后第0、7、14、21、28和35天測量每只小鼠的體質(zhì)量，計算每組的平均體質(zhì)量和凈增體質(zhì)量，以評估重組酵母制劑對小鼠生長性能的影響。

1.7 血免疫細胞數(shù)量

使用1.4中收集的小鼠血樣，每組30 μL，通過MIND-RAY BC-3000血液自動計數(shù)儀測定血液免疫細胞、血小板和血紅蛋白含量。

1.8 Th細胞和Tc細胞

將購自eBioscience的抗小鼠CD4和CD8分子抗體分別用PerCP-Cy5.5和PE進行標記。50 μL小鼠靜脈血與50 μL生理鹽水混合，加入1 μL抗小鼠CD4 PerCP-Cy5.5(0.25 μg/Test)和1 μL抗小鼠CD8a PE(0.25 μg/Test)，在黑暗中孵育30 min。然后加入1 mL(5%V/V)裂解溶液(Becton Dickinson，USA)5 min，以確保紅細胞完全溶解，存活的細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，每次2 500 r·min-1離心5 min。最后，將細胞重懸于150 μL PBS中，并在FACScan流式細胞儀(Becton Dickinson，USA)中進行分析。

1.9 IgG、IgG1和IgG2a

小鼠IgG、IgG1和IgG2a定量ELISA試劑盒購自R & D Systems(USA)。方法參照小鼠IgG(或IgG1、IgG2a) ELISA試劑盒說明書。

1.10 qPCR分析免疫基因表達

100 μL血樣中加入1 mL RNAiso(TaKaRa)，提取總RNA并在42 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min作為向?qū)Щ?TransScriptTMOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，TransGen)。根據(jù)GenBank上的相關(guān)基因序列，設計并合成了免疫基因PCR引物(表2)。

PCR程序為：95 ℃下進行初始變性3 min，然后在95 ℃ 10 s，60 ℃ 5 s，72 ℃ 10 s，循環(huán)40次，并在每次運行中進行陰性對照。以PPIA作為參照基因，使用幾何平均法和以下公式計算3組小鼠免疫相關(guān)基因的mRNA水平：相對水平=2-ΔΔCt。

1.11 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)使用Systat 10(SPSS)進行統(tǒng)計學評估，通過雙因素方差分析和Tukey多重比較分析組間差異。當P<0.05時，差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 重組畢赤酵母的鑒定

用含有100 μg·mL-1博來霉素的YPDS培養(yǎng)基篩選重組酵母，然后提取其RNA并進行qPCR和電泳分析。結(jié)果表明，豬融合AMPs基因在SGP組中成功表達(圖1)；豬IL-2和融合AMPs基因在SG2P組中成功表達(圖2)。

表2 qPCR引物Table 2 The primers for qPCR

圖1 融合抗菌肽重組酵母菌qPCR電泳圖譜(1.5%瓊脂糖凝膠)Fig. 1 Electrophoresis of qPCR of recombinant Pichiapastoris with fusion antimicrobial peptide gene (1.5% agarose gel)

1、2.豬重組抗菌肽片段， M. 20 bp DNA Ladder Marker

1， 2. Porcine antimicrobial peptide fragment， M. 20 bp DNA Ladder Marker

圖2 白細胞介素-2和融合抗菌肽重組酵母菌qPCR電泳圖譜(1.5%瓊脂糖凝膠)Fig. 2 Electrophoresis of qPCR of recombinant Pichiapastoris co-expressing porcine interleulkin-2 and fusion antimicrobial peptide gene (1.5% agarose gel)

A： 1、2、3.豬白細胞介素-2片段， B： 1、2. 豬融合抗菌肽片段； M. 20 bp DNA Ladder Marker

A： 1， 2， 3. Porcine interleukin-2 fragment， B： 1， 2. Porcine fusion antimicrobial peptide fragment； M. 20 bp DNA Ladder Marker

2.2 體外共表達IL-2和融合AMPs的生物活性

與對照組相比，3種發(fā)酵上清液的處理組均顯著促進ConA刺激的豬淋巴母細胞增殖(P<0.05)，而處理組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖3)。

圖3 發(fā)酵上清液刺激豬淋巴母細胞的增殖
Fig. 3 The proliferation of porcine lymphoblasts stimulated with the supernatant samples

SG.空質(zhì)粒酵母菌， SGP. 抗菌肽重組酵母菌， SG2P. 白細胞介素-2和融合抗菌肽重組酵母菌； 下同

SG.Pichiapastoris， SGP. recombinantPichiapastoriswith fusion antimicrobial peptide gene， SG2P. recombinantPichiapastorisco-expressing porcine interleukin-2 and fusion antimicrobial peptide gene； the same below

2.3 重組酵母抗菌活性分析

通過革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌分析重組酵母菌的抗菌活性。在初始濃度下，處理組的細菌生長比對照組受到更顯著抑制(P<0.05)。當稀釋1倍時，處理組的細菌生長也受到抑制，但與對照組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，且處理組間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖4)。

圖4 重組酵母菌的體外抗菌活性Fig. 4 In vitro antimicrobial activity of the recombinant Piciapastoris

Amp. 氨芐青霉素ampicillin， Kana. 卡那霉素kanamycin；*P<0.05； 下同the same below

2.4 攻毒后小鼠存活率

SG2P組和SGP組對大腸桿菌感染的保護率分別為100%和80%，而對照組的保護率僅為20%。同時，用強毒金黃色葡萄球菌注射小鼠腹腔7 d后，處理組的存活率為80%，對照組死亡率高達100%(圖5)。病理剖檢發(fā)現(xiàn)幸存小鼠的器官和組織正常，死亡小鼠病變明顯，肝臟和脾臟嚴重壞死，胃部擴散出血，十二指腸和空腸發(fā)生黏膜炎。

圖5 攻毒后小鼠存活率Fig. 5 Survival rates of mice challenged with virulent Escherichia coli and Staphylococcus aureus

2.5 小鼠體質(zhì)量變化

飼喂一周后，處理組小鼠的體質(zhì)量增加高于對照組(P<0.05)。處理組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖6)。

圖6 小鼠的平均體質(zhì)量變化Fig. 6 The average body mass change of mice after inoculation with SG， SGP and SG2P

2.6 外周血免疫細胞的變化

接種后7～35 d，處理組小鼠白細胞數(shù)量明顯高于對照組(P<0.05)，但處理組間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；盡管實驗期間有一些波動，處理組與對照組紅細胞數(shù)量變化之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；接種后7～35 d，處理組的血紅蛋白含量顯著高于對照組(P<0.05)(圖7)。

2.7 Th細胞和Tc細胞的變化

處理組小鼠血漿中的CD4+和CD8+T細胞數(shù)量在接種后7～35 d顯著高于對照組(P<0.05)，SG2P組CD4+T細胞數(shù)量極顯著高于對照組(P<0.01)；35 d時，CD4+和CD8+T細胞百分比均達到最高(圖8)。

2.8 IgG、IgG1、IgG2a的變化

接種后7～35 d，處理組小鼠的IgG、IgG1、IgG2a均高于對照組，35 d達到最高；但2個處理組間各指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖9)。

圖7 小鼠外周血中血細胞的變化Fig. 7 Change of the blood cells in the peripheral blood of experimental mice

圖8 小鼠外周血中CD4+和CD8+ T細胞數(shù)量Fig. 8 CD4+和CD8+ T cells quantities in the peripheral blood of mice

**P<0.01

圖9 小鼠IgG、IgG1、IgG2a的變化Fig. 9 Changes of IgG， IgG1 and IgG2a in the mice

2.9 免疫基因表達的變化

2.9.1TLRs基因的變化接種后7～35 d，處理組4種TLRs基因表達水平均顯著高于對照組(P<0.05)。接種后35 d，這4種基因的表達水平達到最高。7～21 d，SGP組TLR6 mRNA水平明顯高于SG2P組(P<0.05)。2個處理組間TLR1、TLR4和TLR9表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖10)。

2.9.2免疫記憶相關(guān)基因的表達變化接種后7～35 d，處理組的IL-7、IL-15、IL-23和CD62L基因的表達水平均顯著高于對照組(P<0.05)，但IL-7基因的表達水平在接種第28天與對照組差異無統(tǒng)計學意義。這4個基因的表達水平在接種后35 d達到最高，2個處理組間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖11)。

2.9.3細胞因子基因的表達變化處理組的IL-2、IL-4、IL-6和IL-12基因表達水平在接種后7～35 d顯著高于對照組(P<0.05)，所有基因表達水平在35 d達到最大值。2個處理組間的基因表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖12)。

2.9.4AMPs基因的表達變化接種后7～35 d，處理組的CRP4和CAMP基因表達水平均顯著高于對照組(P<0.05)，接種后35 d達到最大值。2個處理組間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖13)。

3 討論

細胞因子廣泛參與調(diào)節(jié)各種免疫反應，誘導細胞內(nèi)信號通路觸發(fā)一系列生物過程，作為免疫佐劑具有重要的研究價值。目前，許多細胞因子已被用作佐劑以增強原發(fā)性和記憶免疫應答(Kayamuroetal.，2010)。關(guān)于IL-2、IL-12、IFN-γ等細胞因子的研究工作表明，當細胞因子與某種疫苗共同接種時，它們會調(diào)節(jié)抗原特異性免疫應答(Playfair & Souza，1987；Hsiehetal.，1993；Tagliabue & Boraschi，1993)。IL-2作為重要的T細胞生長因子，可以增強巨噬細胞和自然殺傷細胞的活性(Smith，1988；Seretietal.，2004)，同時IL-2基因的轉(zhuǎn)錄和合成常被用作T細胞成功激活的關(guān)鍵指標。AMPs可以直接作用于多種病原體，發(fā)揮多功能效應因子天然免疫作用，如抑制結(jié)合DNA復制和細胞分裂、破壞細胞代謝通路、穿透細胞膜(Yangetal.，2001)。在本研究中，AMPs包含Tritrpticin、PR-39、PMAP-23和PG1基因。Tritrpticin具有回文序列、高度陽離子性質(zhì)和色氨酸殘基中心簇(Lawyeretal.，1996)，已被證明能有效對抗各種微生物、真菌和原生動物(Yangetal.，2002，2003)。PR-39是主要針對革蘭氏陰性菌如大腸桿菌和沙門氏菌Salmonella的有效抗生素，具有抗后生血管作用，抑制沙門氏菌侵入大腸上皮細胞(Isabeletal.，2012)。據(jù)報道，PMAP-23在無溶血活性的情況下，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌有顯著的抗菌活性(Parketal.，2002)。采用2A自剪切技術(shù)連接豬IL-2和AMPs基因，研制出一種新型免疫調(diào)節(jié)分子，使多種基因在同一構(gòu)建體內(nèi)表達(Szymczak & Vignali，2005)。

圖10 小鼠TLR1、TLR4、TLR6、TLR9基因的表達水平Fig. 10 Relative expression levels of TLR1， TLR4， TLR6 and TLR9 genes in the mice

#SG2P vs. SGP：P<0.05

圖11 小鼠IL-7、IL-15、IL-23和CD62L基因的表達水平Fig. 11 Relative expression levels of IL-7， IL-15， IL-23 and CD62L genes in the mice

圖12 小鼠IL-2、IL-4、IL-6和IL-12基因的表達水平Fig. 12 Relative expression levels of IL-2， IL-4， IL-6 and IL-12 genes in the mice

圖13 小鼠CRP4和CAMP基因的表達水平Fig. 13 Relative expression levels of CRP4 and CAMP genes in the mice

在免疫細胞增殖和抑菌試驗中，發(fā)現(xiàn)SG2P組發(fā)酵上清液對體外培養(yǎng)的豬淋巴母細胞的增殖效應明顯強于對照組，與SGP組發(fā)酵上清液差異無統(tǒng)計學意義，說明重組體SGP和SG2P具有比SG更好的免疫生物活性；酶消化的處理組發(fā)酵上清液也有顯著的免疫生物活性。SGP組和SG2P組細菌的生長受到明顯抑制。這些結(jié)果表明，重組體體外具有免疫生物活性和殺菌活性。小鼠體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，處理組的重組酵母顯著提高了TLRs基因(TLR1、TLR4、TLR6、TLR9)、免疫記憶相關(guān)基因(IL-7、IL-15、IL-23、CD62L)、細胞因子基因(IL-2、IL-4、IL-6、IL-12)以及AMPs基因(CRP4和CAMP)的表達水平；同樣，處理組小鼠血液中Th和Tc細胞、IgG、IgG1和IgG2a含量明顯增加；與此相應，強毒細菌注射攻毒也證實處理組小鼠比對照組呈現(xiàn)更高的存活率。

據(jù)報道，TLRs在檢測哺乳動物和昆蟲中的微生物感染方面具有關(guān)鍵作用(Medzhitov，2001)，這些受體通過識別不同病原體中的保守分子模式參與先天免疫應答，并且在激活病原體中發(fā)揮核心作用——特異性體液和細胞適應性免疫應答(Kumaretal.，2009；Kawai & Akira，2010)。Th1細胞產(chǎn)生IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-12，對細胞免疫應答有關(guān)鍵作用。Th2細胞產(chǎn)生IL-4、IL-6和IL-10，主要調(diào)控體液應答反應(Parronchietal.，1991；Romagnani，1991；Sher & Coffman，1992)。免疫記憶相關(guān)基因?qū)τ谔禺愋悦庖呒毎陌l(fā)育、增殖、分化和存活是必需的(Stevcevaetal.，2006)。而細胞因子基因和AMPs基因在動物免疫反應中也發(fā)揮著重要作用。因此，血液中這些免疫基因表達和白細胞的顯著增加，表明重組酵母可以明顯增強小鼠的先天和適應性免疫反應。

因此，重組酵母共表達豬IL-2和融合AMPs能顯著增強小鼠的先天免疫和獲得性免疫力，提高動物的系統(tǒng)性體液和細胞免疫應答，提示可研發(fā)成為新型安全高效的免疫調(diào)節(jié)劑，增強動物對傳染病的免疫抗病力。