何俊霖， 于思， 曹治興， 王雯雯， 張若琪， 李玉芝， 彭成

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，西南特色中藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都611137)

斑馬魚(yú)Danioreriovar.是一種重要的脊椎動(dòng)物模型，其主要生理組織結(jié)構(gòu)、基因遺傳、生物信號(hào)調(diào)控以及疾病特征等與人類相似，在生命科學(xué)研究中已經(jīng)成為被世界廣泛關(guān)注的主要模式生物之一。另外，斑馬魚(yú)具有個(gè)體小、繁殖能力強(qiáng)、易于大量養(yǎng)殖、其透明胚胎能夠直接觀察生理結(jié)構(gòu)變化等多種優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，斑馬魚(yú)對(duì)測(cè)試藥物需求量少，是一種非常適用于中藥有效成分藥理學(xué)研究的動(dòng)物模型(彭蘊(yùn)茹等，2017)。

異甘草素是一種廣泛存在于甘草、黃芪、紅芪、滇黃精等中藥內(nèi)的異黃酮類化合物(展翔，2018)，具有多重藥理活性，可抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗微生物，對(duì)肝以及心血管有一定的保護(hù)作用(Zhaoetal.，2015；Gauretal.，2016；Tanigawaetal.，2016；Gaoetal.，2017；Houetal.，2017；Huetal.，2017)。目前，有關(guān)異甘草素的體實(shí)驗(yàn)研究以嚙齒動(dòng)物為主，而以斑馬魚(yú)為模型的研究甚少。本研究以異甘草素作用于斑馬魚(yú)胚胎，研究其對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育、血管生成及其心臟發(fā)育的影響，以期為異甘草素的深入研究和開(kāi)發(fā)提供參考價(jià)值。

1 材料

1.1 藥物與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

異甘草素(批號(hào)：YGCS20160418，南京春秋生物工程有限公司)用二甲基亞砜(DMSO，批號(hào)：SHBG6226V，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)配成10 mg·mL-1的紫草素母液，實(shí)驗(yàn)時(shí)使用含0.001 5%N-苯基硫脲(PTU，批號(hào)：BCBK8912V，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)的斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。舒尼替尼購(gòu)于南京康滿林化工實(shí)業(yè)有限公司(批號(hào)：S46150)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與主要試劑

斑馬魚(yú)繁育系統(tǒng)(北京愛(ài)生科技發(fā)展有限公司)；MGC-100型恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；M165-FC型體式熒光顯微成像系統(tǒng)(德國(guó)Leica公司)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，批號(hào)：M0202A，大連美侖生物技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 斑馬魚(yú)胚胎的飼養(yǎng)及獲取

斑馬魚(yú)為血管綠色熒光標(biāo)記的Tg(flk1∶GFP)轉(zhuǎn)基因AB品系，由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)自主繁育。飼育條件為：北京愛(ài)生斑馬魚(yú)繁育系統(tǒng)，全封閉循環(huán)，水溫28 ℃，室溫26 ℃，pH7.2～7.5，電導(dǎo)率500～550 μs·cm-1，光照14 h/黑暗10 h交替。選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的斑馬魚(yú)以雌雄比=1∶1進(jìn)行繁育，用隔板將雌雄分開(kāi)，于次晨抽去隔板，2 h后收集斑馬魚(yú)胚胎，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育。

2.2 斑馬魚(yú)胚胎畸形率與存活率的測(cè)定

選取受精后10 h、24 h(hours post fertilization，hpf)發(fā)育正常的斑馬魚(yú)胚胎隨機(jī)置于24孔板，每孔15枚，將原胚胎培養(yǎng)液吸出，立即加入2 mL濃度梯度分別為4 μg·mL-1、6 μg·mL-1、8 μg·mL-1、10 μg·mL-1、12 μg·mL-1、14 μg·mL-1的異甘草素藥液，用0.1%DMSO培養(yǎng)液作為溶劑空白對(duì)照，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于給藥12 h、24 h、36 h、48 h后在顯微鏡下觀察記錄胚胎畸形率與存活率，并拍照。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。斑馬魚(yú)胚胎由透明變?yōu)榘咨蛟陲@微鏡下觀察胚胎開(kāi)始變模糊判定為胚胎死亡?；温视?jì)算公式為：畸形率=畸形胚胎數(shù)/(胚胎總數(shù)-死亡胚胎數(shù))×100%。

2.3 異甘草素對(duì)斑馬魚(yú)胚胎血管生成的影響

斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中，其節(jié)間在10 hpf開(kāi)始發(fā)育，此時(shí)血管開(kāi)始發(fā)育，到36 hpf基本發(fā)育完全(Kimmeletal.，1995)，故選取10 hpf斑馬魚(yú)胚胎研究異甘草素對(duì)其血管生成的影響。取10 hpf發(fā)育正常的斑馬魚(yú)胚胎隨機(jī)置于24孔板，每孔15枚，將原胚胎培養(yǎng)液吸出，立即加入2 mL濃度梯度為2 μg·mL-1、4 μg·mL-1、8 μg·mL-1的異甘草素藥液，用0.1%DMSO培養(yǎng)液作為溶劑空白對(duì)照，并增設(shè)1 μg·mL-1舒尼替尼藥液作為陽(yáng)性對(duì)照，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，注射針脫模后，用1%CMC-Na固定在有凹槽的載玻片上，使其雙眼、體節(jié)重合，在熒光顯微鏡下拍攝斑馬魚(yú)血管的熒光圖像。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 斑馬魚(yú)胚胎心率的測(cè)定

斑馬魚(yú)胚胎心臟在24 hpf左右開(kāi)始搏動(dòng)，72 hpf心臟形態(tài)發(fā)育基本完成，心臟搏動(dòng)也逐漸變得強(qiáng)而有力且趨于平穩(wěn)(Kimmeletal.，1995)，故選擇 24 hpf斑馬魚(yú)胚胎研究異甘草素對(duì)斑馬魚(yú)心臟發(fā)育的影響。取24 hpf發(fā)育正常的斑馬魚(yú)胚胎隨機(jī)置于24孔板，每孔15枚，將原胚胎培養(yǎng)液吸出，立即加入2 mL濃度梯度為2 μg·mL-1、4 μg·mL-1、6 μg·mL-1、8 μg·mL-1、10 μg·mL-1、12 μg·mL-1的異甘草素藥液，用0.1%DMSO培養(yǎng)液作為溶劑空白對(duì)照，每12 h記錄30 s內(nèi)的心率，至給藥后48 h。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 斑馬魚(yú)胚胎心臟形態(tài)的觀察

取24 hpf發(fā)育正常的斑馬魚(yú)胚胎隨機(jī)置于24孔板，每孔15枚，按2.2方法給藥，恒溫培養(yǎng)48 h后，用1%CMC-Na固定，在體視顯微鏡下拍攝心臟形態(tài)圖像。

2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)果

3.1 異甘草素對(duì)斑馬魚(yú)胚胎畸形率的影響

異甘草素在≥6 μg·mL-1劑量下可明顯導(dǎo)致10 hpf、24 hpf斑馬魚(yú)胚胎發(fā)生畸形，并隨著濃度升高，畸形率升高(圖1，圖2)。異甘草素對(duì)10 hpf斑馬魚(yú)胚胎作用24 h后，與空白對(duì)照組相比，4 μg·mL-1異甘草素組個(gè)別胚胎尾部略顯彎曲，8 μg·mL-1異甘草素組脊柱出現(xiàn)輕度彎曲，而12 μg·mL-1異甘草素組尾部嚴(yán)重彎曲(圖3)，且隨著用藥量的增大，斑馬魚(yú)胚胎體型也不同程度地變短變小。

3.2 異甘草素對(duì)斑馬魚(yú)胚胎存活率的影響

異甘草素對(duì)10 hpf、24 hpf斑馬魚(yú)胚胎存活率的影響見(jiàn)表1、表2，異甘草素濃度為6 μg·mL-1時(shí)胚胎開(kāi)始出現(xiàn)死亡，濃度越大、作用時(shí)間越長(zhǎng)，胚胎存活率越低，且24 hpf斑馬魚(yú)胚胎較10 hpf的存活率降低幅度更大。

圖1 異甘草素對(duì)10 hpf斑馬魚(yú)胚胎畸形率的影響(n=3)Fig. 1 Effect of isoliquiritigenin on the deforming rate of zebrafish embryos at 10 hpf (n=3)

圖3 異甘草素作用于10 hpf斑馬魚(yú)胚胎24 h對(duì)胚胎發(fā)育的影響(5×)Fig. 3 Effect of isoliquiritigenin on the growth and development of zebrafish embryos at 10 hpf for 24 h (5×)

箭頭指向斑馬魚(yú)胚胎畸形部位

Arrows point to the deformed part of the zebrafish embryos

3.3 異甘草素對(duì)斑馬魚(yú)胚胎血管生成的影響

與空白對(duì)照組相比，異甘草素濃度為2 μg·mL-1時(shí)即可抑制斑馬魚(yú)胚胎血管的生成，且濃度增加，作用越強(qiáng)，當(dāng)異甘草素濃度為8 μg·mL-1時(shí)，側(cè)血管完全被抑制，其抑制作用強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照組(圖4)。

表1 異甘草素對(duì)10 hpf斑馬魚(yú)胚胎存活率的影響Table 1 Effect of isoliquiritigenin on the survival rate of zebrafish embryos at 10 hpf

注： 與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01； 下同

Notes： Compared with control group，*P<0.05，**P<0.01； the same below

表2 異甘草素對(duì)24 hpf斑馬魚(yú)胚胎的存活率的影響Table 2 Effect of isoliquiritigenin on the survival rate of zebrafish embryos at 24 hpf

圖4 異甘草素作用于10 hpf斑馬魚(yú)胚胎24 h對(duì)血管生成的影響(5×)Fig. 4 Effect of isoliquiritigenin on the angiogenesis of zebrafish embryos at 10 hpf for 24 h (5×)

3.4 異甘草素對(duì)斑馬魚(yú)胚胎心率的影響

異甘草素作用于24 hpf斑馬魚(yú)胚胎的心率見(jiàn)表3，同一時(shí)間點(diǎn)的斑馬魚(yú)胚胎，與空白對(duì)照組相比，給藥組斑馬魚(yú)的心率極顯著降低，且異甘草素濃度越高，心率越低。空白對(duì)照組中，12～48 h斑馬魚(yú)胚胎心率呈逐漸增加的趨勢(shì)，異甘草素濃度為2 μg·mL-1、4 μg·mL-1時(shí)，也呈現(xiàn)心率漸增的趨勢(shì)，而濃度為6 μg·mL-1、8 μg·mL-1時(shí)，卻出現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，濃度為10 μg·mL-1、12 μg·mL-1時(shí)，則呈心率逐漸降低的趨勢(shì)。

3.5 異甘草素對(duì)斑馬魚(yú)胚胎心臟形態(tài)的影響

與空白對(duì)照組相比，給藥組斑馬魚(yú)胚胎的心包(圖5：A中實(shí)線圈區(qū)域)與卵黃囊(圖5：A中虛線圈區(qū)域)腫大，且腫大程度呈劑量依賴。此外，當(dāng)異甘草素濃度為8 μg·mL-1時(shí)，胚胎開(kāi)始出現(xiàn)輕微血液淤滯現(xiàn)象(箭頭指示部位)，當(dāng)異甘草素濃度為12 μg·mL-1時(shí)，表現(xiàn)為嚴(yán)重的血液淤滯現(xiàn)象。

4 討論

異甘草素廣泛存在于甘草、黃芪、紅芪、滇黃精等多味常用無(wú)毒中藥。然而，本研究結(jié)果顯示，異甘草素可影響斑馬魚(yú)胚胎的發(fā)育，中低劑量對(duì)斑馬魚(yú)胚胎有一定的致畸性，而高劑量對(duì)斑馬魚(yú)胚胎產(chǎn)生明顯的致畸和致死性。本研究結(jié)果所表現(xiàn)出的“毒性”主要是由于本研究所測(cè)試異甘草素濃度較高。后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，異甘草素在中低劑量下可表現(xiàn)出明顯的抑制血管生成和降低心率的作用，表明其具有一定的安全性。

表3 異甘草素作用于24 hpf斑馬魚(yú)胚胎心率的影響(n=10)Table 3 Effect of isoliquiritigenin on the heart rate of zebrafish embryos at 24 hpf (n=10)

圖5 異甘草素作用于24 hpf斑馬魚(yú)胚胎48 h對(duì)心臟形態(tài)的影響(8×)Fig. 5 Effect of isoliquiritigenin on the cardiac morphology of zebrafish embryos at 24 hpf for 48 h (8×)

實(shí)線圈區(qū)域?yàn)榘唏R魚(yú)心包， 虛線圈區(qū)域?yàn)榘唏R魚(yú)卵黃囊； 箭頭處為斑馬魚(yú)血液淤滯部位

Real coil area is zebrafish’s pericardium， and imaginary coil area is zebrafish’s saccus omphaloentericus； arrows point to stagnant part of the zebrafish blood

血管生成一般是在已有血管的基礎(chǔ)上，由血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、管腔形成等一系列步驟組合的生物學(xué)過(guò)程(Vandekeereetal.，2015)。研究表明，血管異常生成是癌癥、炎癥、老年黃斑變性等疾病的主要促進(jìn)因素，目前已有舒尼替尼、貝伐單抗等多種血管生成抑制劑用于相關(guān)疾病的治療(Carmeliet & Jain，2000；Yadavletal.，2015)。本研究以舒尼替尼為陽(yáng)性對(duì)照，證實(shí)了異甘草素可顯著抑制斑馬魚(yú)胚胎血管的生成，異草甘素濃度為2 μg·mL-1時(shí)可顯示出抑制作用。已有研究報(bào)道，異甘草素對(duì)膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌以及其他多種癌細(xì)胞具有一定的抗腫瘤活性(Linetal.，2016；Gaoetal.，2017；Huangetal.，2017；Moreno-Londonoetal.，2017；Zhangetal.，2018)。異甘草素可呈劑量依賴型抑制VEGF/VEGFR-2以及MAPK信號(hào)通路抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)增殖、管狀形成、侵襲和遷移能力，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用(Kangetal.，2010；Wangetal.，2013)。因此，推測(cè)本研究中異甘草素主要以抑制內(nèi)皮細(xì)胞生成、遷移和管狀形成的形式抑制血管生成。

心率是反映心臟功能的重要指標(biāo)。本研究顯示，異甘草素作用于24 hpf斑馬魚(yú)胚胎，整體上有減慢心率的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道(Noguchietal.，2008；Zhangetal.，2009，2013)，異甘草素可激活心肌保護(hù)信號(hào)通路，保護(hù)心臟免受缺血再灌注損傷和抗心律失常的作用，并可通過(guò)AMPK信號(hào)通路改善缺氧心肌細(xì)胞收縮功能障礙。其次，異甘草素可通過(guò)增加L型Ca2+電流對(duì)心臟產(chǎn)生正性肌力效應(yīng)并對(duì)K+電流有一定的抑制作用。本研究結(jié)果提示，異甘草素可顯著降低斑馬魚(yú)胚胎心率，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，中低劑量組(2～8 μg·mL-1)斑馬魚(yú)胚胎心率又呈現(xiàn)先降低再略有升高的趨勢(shì)，推測(cè)異甘草素在該濃度范圍內(nèi)對(duì)斑馬魚(yú)胚胎心臟有一定的保護(hù)作用，其保護(hù)作用可能與上述作用有關(guān)。而在劑量較高時(shí)(≥10 μg·mL-1)，對(duì)心率具有持續(xù)的抑制和誘發(fā)心臟畸形的作用，提示高劑量異甘草素會(huì)產(chǎn)生毒副作用。

綜上所述，中低劑量異甘草素對(duì)斑馬魚(yú)胚胎具有良好的抗血管生成和減慢心率的作用，而高劑量有一定毒性。但客觀來(lái)看，藥物均有一定偏性，關(guān)鍵在于如何將藥效最大化而毒性最小化，只要科學(xué)合理使用，定能發(fā)揮藥物的長(zhǎng)處，服務(wù)于人民大眾。