胡 波，于佳妮，張慧方，劉乃剛，郭長青

(1.北京水利醫(yī)院，北京 100036； 2.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120； 3.中日友好醫(yī)院，北京 100029； 4.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

膝骨關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis,KOA)是造成慢性疼痛和殘疾的主要疾病之一，是現(xiàn)代社會一項主要的公共健康問題。膝骨關(guān)節(jié)炎患者人數(shù)眾多，且隨著我國老齡化的不斷加劇，其人數(shù)不斷增加。一項來自中國健康與養(yǎng)老追蹤調(diào)查(China Health and Retirement Longitudinal Study, CHARLS)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示[1]，在全國范圍內(nèi)的17 128例抽檢個體中(45歲以上，平均年齡59.8歲)，癥狀性膝骨關(guān)節(jié)炎的患病率為8.1%，女性(10.3%)多于男性(5.7%)，結(jié)合第6次全國人口普查數(shù)據(jù)，我國45歲以上人口約為4.43億，可以推算出我國癥狀性膝骨關(guān)節(jié)炎的病人數(shù)量約為3 590萬，膝骨關(guān)節(jié)炎的防治形勢面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。膝骨關(guān)節(jié)炎主要表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙，而股四頭肌肌力減弱是造成膝關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙的重要因素[2-4]，對膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病和病情進(jìn)展都有重要的影響。研究顯示[5-6]，正常的肌肉功能在關(guān)節(jié)運動、應(yīng)力吸收及平衡、本體感覺和關(guān)節(jié)穩(wěn)定等方面均發(fā)揮重要的作用，從而保護關(guān)節(jié)、延長關(guān)節(jié)使用壽命。目前，對于膝骨關(guān)節(jié)炎的治療，提高膝關(guān)節(jié)相關(guān)肌肉功能是一項重要措施[7]。針刀療法是一種中醫(yī)原創(chuàng)療法，主要作用于肌肉、韌帶等軟組織[8]，研究表明:[9-10]針刀治療后患者疼痛、功能障礙等癥狀明顯減輕，但針刀治療是否能影響股四頭肌肌力尚未有研究。因此，本研究通過對關(guān)節(jié)軟骨HE染色及Mankin評分、股四頭肌收縮性能的觀察，探討針刀治療KOA的作用機理。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級6月齡新西蘭大白兔28只，購自北京金牧羊?qū)嶒瀯游镳B(yǎng)殖有限責(zé)任公司[許可證號：SCXK京2015-0005]，體質(zhì)量(2.5±0.54)kg，單籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，自然光線照射，室溫(22±2)℃，濕度40%～60%，實驗室定期紫外線消毒。

1.2 實驗材料及儀器

固寶牌樹脂繃帶(珠海麗珠醫(yī)用生物材料有限公司，規(guī)格：15 cm×180 cm)；高分子樹脂繃帶(蘇州可耐特醫(yī)療科技有限公司，規(guī)格：7.5 cm×360 cm)；漢章系列一次性針刀(北京卓越華友醫(yī)療器械有限公司，規(guī)格：0.4 mm×40 mm)；中研太和牌一次性針灸針(北京中研太和醫(yī)藥有限公司，規(guī)格：0.25 mm×25 mm)；HANS穴位神經(jīng)刺激儀(北京華為產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司，LH202H型)；分體式包埋機(德國萊卡，EG1150)；半自動輪轉(zhuǎn)式切片機(德國萊卡，RM2245)；自動化智能型正置研究級顯微鏡(日本奧林巴斯，BX53)；四道生理記錄儀(成都儀器廠，RM-6240)；肌肉張力換能器(成都儀器廠，JH-2204005，50 g)。

1.3 實驗試劑

肌肉緩沖液(1 000 mL臺氏液含：NaCl 8.0 g、10% KCl 2.0 mL、10% MgSO4·7H2O 2.6 mL、5% NaH2PO4·2 H2O 1.3 mL、NaHCO31.0 g、1M CaCl21.8 mL、葡萄糖1.0 g，超純水定容至1 000 mL)；4%多聚甲醛(北京化學(xué)試劑公司)；酒精(北京民生藥業(yè)有限公司)；1%鹽酸(北京華夏藍(lán)籌生物科技有限公司)；二甲苯(北京北化化學(xué)品有限責(zé)任公司)；石蠟(北京化學(xué)試劑公司)；伊紅y(北京伊諾凱科技有限公司)；蘇木素(北京百諾威生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 模型制備

采用改良后Videman左后肢伸直位固定制動法復(fù)制KOA模型：造模前禁食10～16 h，耳緣靜脈注3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)法進(jìn)行麻醉，麻醉后，仰臥固定于操作臺上，先用65℃～85℃熱水浸泡樹脂繃帶使其軟化，然后牽拉兔左后肢使其處于伸直位，以樹脂繃帶從腹股溝到足趾固定動物左下肢(膝關(guān)節(jié)伸直180°，踝關(guān)節(jié)背屈60°)，并在樹脂繃帶內(nèi)側(cè)墊一層脫脂棉，隨后用醫(yī)用紗布將樹脂繃帶固定好后，再外裹2層高分子樹脂繃帶，待定型后外套絲襪以防動物撕咬，剪開絲襪末端留出足趾觀察血供、腫脹等情況。共制動5周，每組隨機選取1只模型兔處死，取關(guān)節(jié)軟骨做形態(tài)學(xué)觀察，示造模成功后，拆除制動材料。

2.2 分組及處理

采用隨機數(shù)字表法將實驗動物分為正常組、模型組、針刀組和電針組4組，每組各7只，其中1只用于造模后形態(tài)學(xué)觀察造模是否成功。實驗過程遵循中華人民共和國科技部頒發(fā)的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)意見》。除正常組外，其余各組動物均采用改良后Videman左后肢伸直位固定制動法復(fù)制KOA模型。

2.3 干預(yù)措施

正常組：正常飼養(yǎng)，不做干預(yù)治療。

模型組：造模后正常飼養(yǎng)，不做干預(yù)治療。

針刀組：拆除制動材料1周后，按照針刀四步進(jìn)針規(guī)程操作，2次/周，共治療4周。具體選點及操作：①股內(nèi)、外側(cè)肌腱止點進(jìn)針點操作：分別松解股內(nèi)、外側(cè)肌肌腱延續(xù)處，針刀刀刃平行于肌腱，刀體與皮膚切面垂直刺入，向肌腱與骨連接方向進(jìn)行松解3～5針;②股直肌肌腱止點：針刀刀刃平行于肌腱，刀體與皮膚切面垂直刺入，向肌腱與骨連接方向進(jìn)行松解3～5針;③股二頭肌肌腱止點：針刀刀刃平行于肌腱，刀體與皮膚切面垂直刺入，向肌腱與骨連接方向進(jìn)行松解3～5針;④條索結(jié)節(jié)點：在膝關(guān)節(jié)周圍進(jìn)行循按觸摸，如有明顯的條索和結(jié)節(jié)，則作為治療點,針刀刀刃平行于條索結(jié)節(jié)，刀體與皮膚切面垂直刺入，向條索和結(jié)節(jié)的縱軸方向進(jìn)行上下松解3～5針。

電針組：拆除制動材料1周后，進(jìn)行電針治療，3次/周，共治療4周。選穴：梁丘、血海、內(nèi)膝眼和外膝眼，均取左側(cè)穴位，梁丘、血海直刺0.8～1.2 cm，內(nèi)膝眼、外膝眼向髕骨方向斜刺0.5～0.8 cm，以HANS穴位神經(jīng)刺激儀分別連接梁丘與血海、內(nèi)膝眼與外膝眼(疏密波，2/100 Hz，3 mA)，留針20 min。

2.4 指標(biāo)檢測與方法

2.4.1 軟骨HE染色 治療結(jié)束1周后，采用麻醉過量法處死動物后進(jìn)行取材，打開膝關(guān)節(jié)腔，切斷膝關(guān)節(jié)周圍韌帶及其他軟組織，切掉半月板,暴露股骨遠(yuǎn)端軟骨，以咬骨鉗快速取下股骨內(nèi)側(cè)髁1 cm×1 cm的軟骨-骨標(biāo)本，以生理鹽水沖洗組織塊上的血液、黏液及污物等，浸入4%多聚甲醛溶液中固定72 h。將軟骨-骨標(biāo)本放入EDTA脫鈣液進(jìn)行脫鈣處理，脫水、透明、透蠟后進(jìn)行石蠟包埋，切片6 μm，蘇木素-伊紅染色，每組選取4個樣本對兔膝關(guān)節(jié)軟骨情況進(jìn)行光鏡觀察，采用盲法讓評分人員對軟骨HE染色光鏡片按照Mankin法[11]進(jìn)行評分。

2.4.2 股四頭肌收縮力學(xué)檢測 治療結(jié)束1周后，取材前進(jìn)行股四頭肌收縮力學(xué)實驗，檢測前動物禁食12 h，耳緣靜脈注射麻醉(3%戊巴比妥鈉,30 mg/kg)。麻醉后，將實驗動物仰臥固定于兔臺,在髕骨下方剪開皮膚，沿肢體縱軸向上剪開皮膚直到大腿根部，繼續(xù)向上剪開皮膚3～4 cm，小心剝離皮膚、筋膜,暴露肌層。切斷髕韌帶，小心分離股四頭肌至髂骨連接處，保持股四頭肌與髂骨處于連接狀態(tài)。將手術(shù)縫合線結(jié)扎于髕骨與股四頭肌的肌腱連接處，牽拉肌肉到自然狀態(tài)下的長度后連接于張力換能器，保持肌肉上結(jié)扎線、肌肉走行、張力換能器上的結(jié)扎線在一條直線上。

將張力換能器固定于支架上，將換能器上的信號采集線連接于MR-6240生物信號采集系統(tǒng)處理器。刺激電極平行扎入股四頭肌肌腹，避免電極相互接觸。啟動示波按鈕，調(diào)節(jié)張力換能器在支架上的位置使基線維持在-2后歸零。選擇刺激器的刺激參數(shù)，波寬5 ms，延時10 s，先采用單刺激，刺激強度從零開始逐漸微調(diào)遞增，每次增加0.1 v的刺激強度，觀察肌肉收縮曲線變化及收縮幅度，直至找到股四頭肌單收縮的最大收縮幅度(Pt)，并記錄。利用引起肌肉單收縮的最大刺激幅度的60%為基線給予肌肉連續(xù)刺激，逐漸加大刺激幅度，觀察肌肉收縮曲線變化，直到找到股四頭肌強直收縮的最大收縮幅度(Pt)并記錄。在肌肉每次收縮后，都給予肌肉30 s的休息時間，并不斷滴加肌肉緩沖液。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組兔軟骨HE光鏡觀察結(jié)果比較

正常組兔膝關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)完整，由淺入深可見表淺層、移行層、輻射層和鈣化層，四層結(jié)構(gòu)清晰可辨。表淺層軟骨細(xì)胞較小，呈扁平狀，其長軸與軟骨表面平行，單個分布;移行層細(xì)胞呈圓形, 大小差別不大, 排列無規(guī)律，細(xì)胞分裂增生形成同源群;輻射層多個細(xì)胞呈柱狀排列, 與軟骨表面垂直，細(xì)胞間質(zhì)較多,潮線清晰完整,無軟骨細(xì)胞簇集現(xiàn)象，無血管翳生成。

模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨層次紊亂，四層結(jié)構(gòu)分辨不清，表層和移形層軟骨分層剝脫，部分區(qū)域剝脫至輻射層，表層和移形層軟骨細(xì)胞彌漫性增生，細(xì)胞簇集現(xiàn)象嚴(yán)重(如封三彩圖1中箭頭所指)，潮線消失，放射層可見少量軟骨細(xì)胞呈柱狀排列。

電針組兔軟骨結(jié)構(gòu)尚清晰，軟骨表面不規(guī)則，軟骨細(xì)胞蔟集現(xiàn)象嚴(yán)重(如封三彩圖1中箭頭所指)，但仍可見到輻射層軟骨細(xì)胞柱狀排列，潮線模糊不清，未見血管翳生成。

針刀組兔膝關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)較清晰，可見表層、移行層、輻射層和鈣化層，軟骨表面欠光滑，軟骨細(xì)胞排列稍紊亂，軟骨表層、移行層局部可見軟骨細(xì)胞簇集現(xiàn)象(如封三彩圖1中箭頭所指)，輻射層軟骨細(xì)胞仍呈柱狀排列，排列較規(guī)則，與軟骨表面垂直，細(xì)胞分裂成同源群，潮線較模糊，未見血管翳生成。見封三彩圖1。

3.2 各組兔軟骨HE染色光鏡Mankin評分比較

造模組后，模型組兔軟骨HE染色光鏡Mankin評分較正常組明顯升高(P<0.01)。電針、針刀干預(yù)后，兩組兔軟骨HE染色光鏡Mankin評分較模型組顯著降低(P<0.01)，針刀組兔軟骨HE染色光鏡Mankin評分較電針組顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組兔軟骨HE染色光鏡Mankin評分比較

注：與正常組比較,**P<0.01；與模型組比較,##P<0.01；與電針組比較,▲P<0.05

3.3 各組兔股四頭肌收縮力學(xué)結(jié)果比較

造模后，模型組兔在股四頭肌單收縮幅度和強直收縮幅度上較正常組均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。干預(yù)治療后，電針組兔在股四頭肌單收縮幅度和強直收縮幅度上較模型組無顯著差異(P>0.05)，針刀組兔在股四頭肌單收縮幅度和強直收縮幅度上較模型組顯著升高(P<0.05或P<0.01)，較電針組顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組兔股四頭肌收縮力學(xué)結(jié)果比較

注：與正常組比較,*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較,#P<0.05，##P<0.01；與電針組比較,▲P<0.05

4 討論

KOA是一種與年齡相關(guān)的退行性疾病，性別、體重、內(nèi)分泌代謝及生物力學(xué)等諸多因素都能影響KOA的進(jìn)展，其中生物力學(xué)因素起到至關(guān)重要的作用。正常的膝關(guān)節(jié)活動需要骨、韌帶等提供靜力性穩(wěn)定，而肌肉提供動力性穩(wěn)定，正常的肌肉功能可維持膝關(guān)節(jié)的良性應(yīng)力分布，從而維持正常膝關(guān)節(jié)軟骨合成分解代謝平衡[12]。在膝骨關(guān)節(jié)炎患者，肌肉功能下降，尤其是股四頭肌肌力下降是引發(fā)膝關(guān)節(jié)應(yīng)力失衡的主要誘因之一，進(jìn)而造成KAO的發(fā)生和加重[13-14]。

研究發(fā)現(xiàn)[15]:膝關(guān)節(jié)周圍的肌肉只在緊張狀態(tài)下加載，對膝關(guān)節(jié)起到支持作用。也就是說，肌肉主動收縮功能越強，對膝關(guān)節(jié)的支持作用越大，膝關(guān)節(jié)越穩(wěn)定。根據(jù)肌骨生物力學(xué)的理論，在正常情況下，骨骼肌的收縮形式包括單收縮和強直收縮兩種方式。肌肉接受支配它的運動神經(jīng)發(fā)出的一次刺激后產(chǎn)生的機械性反應(yīng)，稱單收縮。單收縮是能記錄到的肌肉活動的基本單位。當(dāng)給予肌肉刺激的頻率越高時，肌肉收縮頻率越快，肌肉產(chǎn)生的張力越大。當(dāng)肌肉的收縮融合并維持在最大張力時，肌肉發(fā)生強直收縮，而強直收縮是骨骼肌能產(chǎn)生流暢運動的重要機制，骨骼肌功能主要以強直收縮的方式來完成。因此，測定骨骼肌的單收縮和強直收縮最大幅度是分析判斷肌肉的收縮功能的重要指標(biāo)。

本實驗結(jié)果顯示：造模后，模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨HE染色顯示軟骨結(jié)構(gòu)紊亂、破壞，Mankin評分較正常明顯升高(P<0.01)，股四頭肌單收縮幅度和強直收縮幅度較正常均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，說明造模后，關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)退變，股四頭肌肌力出現(xiàn)下降。電針、針刀干預(yù)后，電針組兔膝關(guān)節(jié)軟骨HE染色較模型組有所改善，Mankin評分較模型組顯著降低(P<0.01)，股四頭肌單收縮幅度和強直收縮幅度較模型組無顯著差異(P>0.05)；針刀組兔膝關(guān)節(jié)軟骨HE染色較模型組改善明顯，Mankin評分較模型組顯著降低(P<0.01)，股四頭肌單收縮幅度和強直收縮幅度上較模型組顯著升高(P<0.05或P<0.01)，且與電針組相比，Mankin評分顯著降低(P<0.05),股四頭肌單收縮幅度和強直收縮幅度上顯著升高(P<0.05)。說明電針和針刀干預(yù)均可以改善KOA模型兔關(guān)節(jié)軟骨的退變，并改善股四頭肌肌力，且針刀干預(yù)要明顯優(yōu)于電針干預(yù)。

針灸療法是我國的傳統(tǒng)醫(yī)療技術(shù)，是治療KOA的有效方法之一[16]，并且已被全世界認(rèn)可和接受，成為多個國際KOA臨床指南的推薦療法。針刀療法源于針灸療法，同時又融合了外科手術(shù)學(xué)的某些技巧，形成了一種獨具特色的臨床治療方法，在肌肉骨骼系統(tǒng)疾病方面較傳統(tǒng)針灸療法有明顯的優(yōu)勢[17]。筆者前期的臨床研究[18]顯示電針、針刀治療可以改善患者的膝周軟組織張力，且針刀治療優(yōu)于電針治療。多個相關(guān)臨床研究[19-21]也有顯示針刀對于膝骨關(guān)節(jié)炎有較好的臨床效果。本實驗通過關(guān)節(jié)軟骨HE染色及Mankin評分、活體肌肉收縮性能檢測表明，針刀干預(yù)可以改善模型兔關(guān)節(jié)軟骨的退變，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)，同時可提高股四頭肌的收縮性能，提高股四頭肌肌力，且各項指標(biāo)均優(yōu)于電針干預(yù),與臨床研究結(jié)果相符。針刀干預(yù)可以提高股四頭肌的收縮性能是其治療KOA的重要機制之一。