汪 偉， 何孔旺， 溫立斌， 肖 琦， 倪艷秀

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210014)

人參(ginseng)是傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥，具有補(bǔ)氣生血、扶正祛邪等功效。人參還具有多方面的藥理和生物活性，含有多種類型的化學(xué)成分，人參皂苷(ginseng saponins，簡(jiǎn)稱GS)是人參主要的有效成分之一[1]。迄今已從人參中分離到40余種皂苷[2]，其中以人參皂苷Rb1含量最高[3]。目前大量研究表明，GS在免疫答應(yīng)中具有較好的佐劑作用[4]，能夠顯著提高體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫答應(yīng)[5]。豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，簡(jiǎn)稱PCV)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，為無囊膜、單鏈負(fù)股DNA病毒，于1982年由Tischer等首次發(fā)現(xiàn)[6]，是目前發(fā)現(xiàn)最小的病毒之一，有2個(gè)血清型；其中，豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)對(duì)豬群具有致病性，是豬圓環(huán)病(porcine circovirus diseases，簡(jiǎn)稱PCVD)的主要病原[7]。PCV2影響豬機(jī)體的免疫系統(tǒng)功能的發(fā)揮，從而產(chǎn)生免疫抑制[8]，給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[9]。該病目前仍無有效治療措施，疫苗接種是預(yù)防PCV2感染的主要途徑[10-12]。本研究旨在探索將人參皂苷Rb1單體作為免疫增強(qiáng)劑與PCV2疫苗混合后使用，研究人參皂苷Rb1對(duì)PCV2疫苗的免疫增強(qiáng)效果，為PCV2疫苗更好地發(fā)揮作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

20只清潔級(jí)Babc/c雌性小鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。本試驗(yàn)于2016年4—6月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物試驗(yàn)中心進(jìn)行。

1.2 試劑與儀器

2%氫氧化鋁佐劑，由北京希凱創(chuàng)新科技有限公司提供；人參皂苷Rb1單體標(biāo)準(zhǔn)品、純度98.0%以上，由南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司提供；用生理鹽水配制成濃度為10 mg/mL，0.22 μm 濾器過濾除菌；病毒DNA提取試劑盒，由北京天恩澤科技有限公司；ABI 7500熒光定量PCR儀，由美國(guó)ABI公司提供。

1.3 PCV2疫苗抗原及攻毒用PCV2強(qiáng)毒

PCV2疫苗抗原由筆者所在實(shí)驗(yàn)室用昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)獲得，抗原濃度為10 μg/mL。攻毒用PCV2強(qiáng)毒，為筆者所在實(shí)驗(yàn)室自行分離鑒定并由PK-15細(xì)胞傳代獲得，IFA測(cè)得其TCID50為10-6/mL。

1.4 疫苗制備與動(dòng)物免疫

以總體積1 400 μL無菌配制疫苗，混勻后4 ℃放置 72 h。將小鼠隨機(jī)分為4組(表1)，疫苗免疫前再次混勻，每只小鼠腹腔免疫疫苗200 μL。

1.5 PCV2血清抗體檢測(cè)

表1 試驗(yàn)分組與疫苗配制

1.5.2 比較3種配方疫苗免疫后21 d抗體效價(jià) 將各組 21 d 小鼠血清作50、100、200、400、800、1 600倍稀釋，用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的PCV2抗體間接ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)血清抗體效價(jià)。具體檢測(cè)方法同“1.5.1”節(jié)。

1.6 PCV2強(qiáng)毒攻毒

免疫后21 d，對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔攻毒，每只小鼠注射 300 μL 病毒液；攻毒后28 d，眼球采血并處死所有小鼠。

1.7 血清病毒載量檢測(cè)

用病毒DNA提取試劑盒提取小鼠血清病毒DNA，用筆者所在實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的PCV2熒光定量PCR方法檢測(cè)血清中的病毒載量。熒光定量PCR經(jīng)優(yōu)化，25 μL反應(yīng)體系如下：2×Premix ExTaq(Probe qPCR)12.5 μL，上、下游引物(10 μmmol/L)各0.5 μL，探針(10 μmol/L)0.5 μL，ROX Reference DyeⅡ(50×)0.5 μL，質(zhì)粒模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。引物與探針序列如表2所示。

表2 PCV2熒光定量PCR檢測(cè)方法的引物與探針

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)在SPSS 22.0軟件下采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫后的抗體滴度和抗體效價(jià)

2.1.1 抗體滴度隨免疫時(shí)間的變化 3種配方的疫苗免疫小鼠后，均可刺激小鼠產(chǎn)生PCV2特異性抗體。其中C、D組在免疫后14 d，血清即轉(zhuǎn)陽；在14 d時(shí)，C、D組血清D450 nm明顯高于A、B組。而B組血清仍為陰性，其在21 d血清才轉(zhuǎn)陽(圖1)。另在免疫后14、21 d，D組血清D450 nm均要略高于C組，但差異不顯著。添加人參皂苷Rb1的2組疫苗，其產(chǎn)生特異性抗體時(shí)間要早于不添加組疫苗。

2.1.2 3種配方疫苗免疫后21 d抗體效價(jià)差異 D組疫苗產(chǎn)生的抗體滴度明顯高于B、C組；同時(shí)，C組整體抗體效價(jià)也高于B組，但無顯著差異。添加人參皂苷Rb1的疫苗抗體效價(jià)要高于不添加的疫苗，且高劑量組抗體滴度高于低劑量組(圖2)。

2.2 攻毒后血清病毒載量

攻毒后28 d，檢測(cè)小鼠血清病毒載量，未免疫組(A組)血清病毒載量明顯高于疫苗免疫組(P<0.01)(圖3)。高劑量組血清病毒陽性率也明顯低于其他組，結(jié)果表明，高劑量人參皂苷Rb1具有較高的抑制病毒增殖的功效(表3)。

3 結(jié)論與討論

將人參皂苷Rb1單體與PCV2疫苗混合免疫小鼠后，能夠明顯縮短抗體產(chǎn)生時(shí)間，顯著提高抗體效價(jià)，降低血清病毒載量及血清病毒陽性率，具有較好的免疫增強(qiáng)效果，是一種較好的免疫增強(qiáng)劑。

人參皂苷能夠顯著提高機(jī)體的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，其機(jī)制可能是激活機(jī)體的先天性免疫[13]。目前有研究將人參皂苷Rb1作為佐劑或免疫增強(qiáng)劑與不同病原疫苗混合后免疫動(dòng)物，均可以產(chǎn)生免疫增強(qiáng)作用。Rivera等將人參皂苷Rb1與豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus，簡(jiǎn)稱PPV)疫苗混合后免疫，能夠顯著提高疫苗抗體應(yīng)答，并誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子，結(jié)果表明激活了Th1、Th2答應(yīng)[14-15]。史秀山將人參皂苷Rb1作為人用純化非洲綠猴腎細(xì)胞(vero細(xì)胞)狂犬病疫苗的佐劑免疫小鼠，結(jié)果表明，單針免疫加入人參皂苷Rb1后抗體效價(jià)高且抗體產(chǎn)生時(shí)間早，且加入人參皂苷Rb1后抗體水平達(dá)到5針常規(guī)免疫抗體水平[16]。Zhang等將人參皂苷制備成納米粒子佐劑與雞艾美兒球蟲重組抗原形成重組亞單位疫苗，能夠促使疫苗產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)[17]。胡松華等將人參皂苷Rb1以及氫氧化鋁膠作為佐劑和金黃色葡萄球菌菌體抗原混合免疫豚鼠，并用Rb1和奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌菌苗混合免疫奶牛[18]；結(jié)果表明，Rb1組豚鼠血清抗體滴度比對(duì)照組和氫氧化鋁膠佐劑組增加快，幅度顯著增高，Rb1組奶牛血清抗體滴度比對(duì)照組奶牛顯著增加。以上研究均表明，人參皂苷及其單體具有良好的免疫增強(qiáng)作用，可作為新的佐劑成分用于疫苗生產(chǎn)。

表3 小鼠血清PCV2病毒陽性率

本研究表明，人參皂苷Rb1能夠增加PCV2疫苗的免疫效果，是一種較好的免疫增強(qiáng)劑，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。