伍革民， 張 繼， 唐繼高

(1.貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州貴陽(yáng) 550005； 2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550000)

貴州省地方雞種資源豐富，其中赤水烏骨雞等7個(gè)品種已編入《貴州省畜禽品種志》，還有一些地方雞種如普安烏骨雞、水西烏骨雞等群體尚未編入，由于地理、環(huán)境等各種因素，它們?nèi)狈σ?guī)?；曫B(yǎng)、品種資源保護(hù)利用和開(kāi)發(fā)研究。普安縣烏骨雞主產(chǎn)于云貴高原中段的貴州省西南部烏蒙山區(qū)普安縣新店鄉(xiāng)等地，歷史上無(wú)記載，是一種獨(dú)特的烏骨雞品種，有黑羽、麻羽等羽色類(lèi)型，黑羽烏骨雞基本是農(nóng)戶散養(yǎng)，缺少專(zhuān)業(yè)化飼養(yǎng)和規(guī)模化養(yǎng)殖[1]。水西烏骨雞主要產(chǎn)于貴州省黔西縣新仁鄉(xiāng)等地，養(yǎng)殖歷史較長(zhǎng)，該烏骨雞體格健壯，對(duì)疾病的抵抗能力強(qiáng)，常年以青菜、統(tǒng)糠、稻谷等為食，耐粗飼，喜食山坡草籽、昆蟲(chóng)，覓食能力強(qiáng)，皮、骨、肉及內(nèi)臟為烏色，肉質(zhì)鮮美。為充分開(kāi)展這些地方雞種資源的保護(hù)和利用，有必要了解它們的遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系。在應(yīng)用于遺傳結(jié)構(gòu)或親緣關(guān)系檢測(cè)的多態(tài)性標(biāo)記中，微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)量多，研究成熟、分布廣、共顯性、易于檢測(cè)，因而應(yīng)用廣泛。本研究選擇7個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)普安烏骨雞、赤水烏骨雞、水西烏骨雞和廣西烏骨雞的遺傳多樣性進(jìn)行檢測(cè)，并分析飼養(yǎng)于貴州省的4個(gè)烏骨雞群體間的遺傳關(guān)系，可為這些品種或群體的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用的4個(gè)雞品種為普安烏骨雞、赤水烏骨雞、水西烏骨雞和廣西烏骨雞，其中普安烏骨雞、赤水烏骨雞和水西烏骨雞是貴州省本地長(zhǎng)期飼養(yǎng)和培育的地方雞種，廣西烏骨雞從廣西壯族自治區(qū)東蘭縣引進(jìn)，后在貴州長(zhǎng)期飼養(yǎng)。每個(gè)品種樣本數(shù)為30羽，采用翅下靜脈采血1.0～1.5 mL/羽，-20 ℃保存。

參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道[2～7]，選擇位點(diǎn)分布多的7對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記。引物位置、退火溫度及序列等信息見(jiàn)表1。

1.2 方法

采用血液DNA提取試劑盒提取DNA。20 μL PCR反應(yīng)體系包括2×TaqPCR MasterMix 10 μL、引物各1 μL、100 ng/μL 模板DNA 1 μL、去離子水7 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)熱3 min后進(jìn)行35個(gè)PCR循環(huán)，然后72 ℃延伸 5 min。35個(gè)PCR循環(huán)參數(shù)包括95 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見(jiàn)表1)，72 ℃延伸30 s。1.0%～1.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，8%～10%聚丙烯酰胺凝膠分離PCR產(chǎn)物，銀染顯色和凝膠成像照相保存，使用Labworks軟件分析片段大小并進(jìn)行分型。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

1.3.1 群體內(nèi)遺傳多樣性分析 等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、等位基因頻率、觀測(cè)和期望雜合度、種群近交系數(shù)等遺傳多樣性指標(biāo)使用PopGen 3.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)根據(jù)以下公式計(jì)算：

表1 7對(duì)微衛(wèi)星引物信息

式中：n為等位基因數(shù)；Pi和Pj分別為群體中第i個(gè)和第j個(gè)等位基因頻率。

1.3.2 群體間遺傳關(guān)系分析 根據(jù)等位基因頻率，利用PopGen 3.2軟件計(jì)算4個(gè)群體之間的遺傳距離，構(gòu)建4個(gè)烏骨雞群體系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星DNA多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果

7個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記(MCW0005、MCW035、MCW0166、LEI0217、LEI0089、ADL16、ADL201)分別檢測(cè)出5、4、3、4、6、6、4個(gè)等位基因。等位基因頻率見(jiàn)表2。

表2 4個(gè)烏骨雞雞群體等位基因頻率

2.2 群體內(nèi)遺傳多樣性

4個(gè)烏骨雞群體7個(gè)微衛(wèi)星座位平均基因雜合度(H)和多態(tài)信息含量(PIC)見(jiàn)表3。

從表3可知，試驗(yàn)用的4個(gè)雞群體在7個(gè)微衛(wèi)星基因座均表現(xiàn)出較高的基因雜合度，各群體平均雜合度為0.727 2(0.706 9～0.738 5)，其中雜合度最高的是赤水烏骨雞的ADL166座位，為0.802 8。在4個(gè)烏骨雞群體中，各基因座群體雜合度和多態(tài)信息含量均大于0.50，說(shuō)明7個(gè)微衛(wèi)星基因座在這些雞群體中遺傳變異幅度較大。不同基因座在不同群體中雜合度和多態(tài)信息含量存在差異，其中廣西烏骨雞多態(tài)信息含量和雜合度最高。

表3 4個(gè)烏骨雞雞群體7個(gè)微衛(wèi)星座位的雜合度和多態(tài)信息含量

2.3 群體間遺傳關(guān)系

4個(gè)烏骨雞群體間的遺傳距離見(jiàn)表4。由表4可知，4個(gè)雞群體遺傳距離均較近，在0.05以下，其中廣西烏骨雞和水西烏骨雞之間的遺傳距離最遠(yuǎn)，為 0.044 8，與赤水烏骨雞的遺傳距離最近，為0.019 4。

表4 4個(gè)烏骨雞群體之間的標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離(Ds)

根據(jù)Nei氏標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離[8]，應(yīng)用PopGen 3.2軟件中的UPGMA程序構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可知，4個(gè)雞群體可以分為三大類(lèi)：水西烏骨雞聚為一類(lèi)，普安烏骨雞聚為一類(lèi)，赤水烏骨雞和廣西烏骨雞聚為一類(lèi)。

3 討論與結(jié)論

3.1 微衛(wèi)星DNA多態(tài)性與群體內(nèi)遺傳多樣性

為準(zhǔn)確說(shuō)明一個(gè)群體或品種的遺傳多樣性水平，應(yīng)選用在該群體內(nèi)多態(tài)性含量高的基因座位進(jìn)行檢測(cè)和分析。采用多態(tài)信息含量(PIC)來(lái)衡量基因座多態(tài)性情況，當(dāng)PIC>0.5時(shí)，該座位高度多態(tài)。本研究中用于多樣性分析的7個(gè)微衛(wèi)星座位在所有5個(gè)群體中的多態(tài)信息含量均在0.5以上，因此本試驗(yàn)的結(jié)果具有一定的參考價(jià)值。采用雜合度來(lái)評(píng)估群體內(nèi)遺傳變異程度，本研究中的4個(gè)烏骨雞群體的7個(gè)微衛(wèi)星座位的平均雜合度在0.706 9～0.738 5，均在 0.70 以上，說(shuō)明4個(gè)烏骨雞群體遺傳多樣性豐富，同時(shí)也說(shuō)明在利用與推廣這些地方群體時(shí)，還必須對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步純繁選育。上述雞養(yǎng)殖方式基本為散養(yǎng)，缺乏系統(tǒng)選育，說(shuō)明研究結(jié)果與實(shí)際情況相符。

3.2 群體間遺傳關(guān)系

赤水烏骨雞主產(chǎn)于貴州省赤水市，又名竹鄉(xiāng)雞，屬于蛋肉兼用型地方品種[9-10]；普安烏骨雞主產(chǎn)于貴州省西南部烏蒙山區(qū)普安縣新店鄉(xiāng)等地，歷史上無(wú)記載，是一種獨(dú)特的烏骨雞品種；水西烏雞主產(chǎn)于黔西縣新仁鄉(xiāng)，養(yǎng)殖歷史悠久；普安烏骨雞和水西烏雞均未入《貴州省品種志》，很少開(kāi)展資源保護(hù)評(píng)價(jià)和開(kāi)發(fā)利用；廣西烏骨雞從廣西壯族自治區(qū)東蘭縣引進(jìn)，后在貴州長(zhǎng)期飼養(yǎng)。從本研究根據(jù)遺傳距離對(duì)上述4個(gè)烏骨雞群體構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)來(lái)看，廣西烏骨雞與赤水烏骨雞遺傳距離近，聚為一類(lèi)，可能與這2個(gè)雞種進(jìn)化及育種歷史相似、均屬于蛋肉兼用型烏骨雞品種有關(guān)。水西烏骨雞與普安烏骨雞各自聚為一類(lèi)，可能是地理、氣候等因素造成的。上述4個(gè)烏骨雞群體之間的遺傳距離較小，均在 0.05 以下，這可能與它們均屬于烏骨雞有關(guān)。