蔣宏寶，王 娜，簡俊濤，張 震，許喜棠，張小燕，魏紅升，王成社,謝彥周

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，陜西楊凌712100； 2.南陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南南陽 473000)

一般認(rèn)為高等植物葉綠素合成過程可分為三步，其中第一步為5-氨基乙酰丙酸(δ-aminoaevulinic acid,ALA)的形成[1]。ALA是生物體所有四吡咯化合物生物合成的前體[2]，研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的ALA可以作為無毒、無污染的農(nóng)田除草劑[3]，合適濃度的ALA還可以作為植物生長調(diào)節(jié)劑，提高農(nóng)作物的抗寒性[4]、抗鹽性[5-6]和產(chǎn)量[7]。5-氨基乙酰脫水酶(δ-aminoaevulinic acid dehydratase,ALAD)催化兩分子的ALA縮合成膽色素原(porphobilinogen,PBG)，進(jìn)一步在四吡咯化合物如維生素 B12、血紅素和葉綠素等許多生物分子的合成過程中起到不可替代的作用[2]。ALAD酶作為 ALA代謝途徑的下游關(guān)鍵酶，其活性極大地影響了 ALA在植物體內(nèi)的積累和代謝，對植物的生長發(fā)育具有重要意義[8]。在小麥中，ALAD基因的相關(guān)研究報道較少，Takenouchi等[9]發(fā)現(xiàn)，小麥ALAD1對質(zhì)體中ALA的代謝具有催化活性，且 TaALAD1>在轉(zhuǎn)基因植物中的異位表達(dá)增強(qiáng)了其對高濃度ALA應(yīng)用的耐受性，但該研究并未確定 TaALAD1>基因在染色體上的具體位置。

隨著小麥基因組數(shù)據(jù)庫日臻完善和中國春1.0 基因組版本的釋放[10-11]，使得利用生物信息學(xué)方法對小麥基因進(jìn)行鑒定和分析成為可能[12-14]。本研究利用生物信息學(xué)手段對ALAD基因進(jìn)行鑒定、表達(dá)分析和突變體分析，以期為后續(xù)的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 序列的下載

擬南芥ALAD基因(AT1G69740和AT1G44318)編碼的蛋白質(zhì)序列從TAIR(www.arabidopsis.org)下載，水稻ALAD基因(OS06G0704600)從RAP(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/index.html)下載。以擬南芥和水稻ALAD基因的編碼蛋白序列為探針，在WHEAT URGI(http://www.wheatgenome.org/News/Latest-news/IWGSC-Whole-Genome-Assembly-now-available-at-URGI)比對小麥ALAD基因的序列，下載高可信度的小麥ALAD基因序列。以小麥ALAD基因編碼蛋白序列為探針，在NCBI-BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)進(jìn)行比對，下載擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、大麥(Hordeumvulgare)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、薺菜(Capsella-rubella)、白菜(Brassicarapa)、雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)、番木瓜(Garicapapaya)、橡膠樹(Heveabrasiliensis)、川桑(Morusnotabilis)、烏拉爾圖小麥(Triticumurartu)、擬斯卑爾脫山羊草(Aegilopsspeltoides)和粗山羊草(Aegilopstauschii)的蛋白序列。

1.2 生物信息學(xué)分析

采用ExPASy-Compute pI/Mw(http://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測小麥ALAD基因編碼蛋白的分子量和等電點(diǎn)。采用Clustal W軟件比對ALAD蛋白序列，比對時采用默認(rèn)參數(shù)；采用MEGA 7.0軟件基于鄰接法(Neighbor-joining Method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉檢測次數(shù)為1000。

將小麥ALAD基因序列提交到WheatExp(http://wheat.pw.usda.gov/WheatExp/)，分析ALAD基因在不同組織和不同逆境條件的表達(dá)情況。將小麥ALAD基因序列提交到小麥TILLING數(shù)據(jù)庫(http://dubcovskylab.ucdavis.edu/wheat-tilling/sample-search 或http://www.wheat-tilling.com/)進(jìn)行突變位點(diǎn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥ALAD基因的鑒定結(jié)果

通過對普通小麥中國春基因組數(shù)據(jù)庫的檢索，一共發(fā)現(xiàn)6個TaALAD基因，基因組全長為3 608～5 092 bp，其中TraesCS7A01G415000.1、TraesCS7B01G314800.1和TraesCS7D01G408000.1位于第七同源群染色體長臂，分別命名為 TaALAD-A1>、 TaALAD-B1>和 TaALAD-D1>；而TraesCS6A01G107900.1、TraesCS6B01G136500.2和TraesCS6D01G095800.1位于第六同源群染色體短臂，分別命名為 TaALAD-A2>、 TaALAD-B2>和 TaALAD-D2>(表1)。6個普通小麥ALAD蛋白的分子量范圍為45.53～49.50 KDa,TaALAD-D2的分子量最大，TaALAD-B2的分子量最小。普通小麥ALAD的等電點(diǎn)介于5.58～7.68之間，TaALAD-D2的等電點(diǎn)最大，TaALAD-B1和TaALAD-D1的等電點(diǎn)最小。

表1 普通小麥ALAD基因的特征Table 1 Characteristics of ALAD genes in common wheat

2.2 小麥ALAD基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

用ClustalW軟件對普通小麥及其祖先種的ALAD蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明，ALAD-1和ALAD-2蛋白在氨基酸組成上存在較大差異，但都含有比較保守的ALAD結(jié)構(gòu)域(圖1)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，單子葉植物和雙子葉植物的ALAD蛋白分別處在不同分支。普通小麥ALAD-1和ALAD-2蛋白分成兩組； TaALAD-A1、TaALAD-B1、 TaALAD-D1和TaALAD-D2分別與它們的祖先種聚為一組(圖2)。

2.3 小麥ALAD基因的表達(dá)分析

本研究利用從WheatExp數(shù)據(jù)庫下載的小麥ALAD基因在根、莖、葉、穗和籽粒的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對該基因進(jìn)行了表達(dá)分析，結(jié)果表明(表2)， TaALAD>基因在葉片中的表達(dá)量最高， TaALAD-1>基因在所有組織的表達(dá)量都遠(yuǎn)高于 TaALAD-2>基因，而且在根部和籽粒發(fā)育后期的表達(dá)量極低甚至不表達(dá)，但其最高表達(dá)量也是出現(xiàn)在葉片中。

在干旱脅迫1 h或6 h的條件下， TaALAD-1>和 TaALAD-2>基因的表達(dá)量幾乎不受影響。 TaALAD-1>的表達(dá)量在熱脅迫1 h下調(diào)，而在熱脅迫6 h時上調(diào)。 TaALAD-2>基因的表達(dá)量幾乎不受熱脅迫的影響(表3)。

2.4 小麥ALAD基因的突變體分析

本研究對6個小麥ALAD基因在小麥TILLING數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，6個小麥ALAD基因都找到了一些突變位點(diǎn)，都發(fā)現(xiàn)了數(shù)目不同的無義突變、終止位點(diǎn)突變、剪切位點(diǎn)突變，但只有 TaALAD-B2>和 TaALAD-D2>發(fā)現(xiàn)了起始位點(diǎn)突變，這些突變位點(diǎn)可能影響TaALAD基因的功能(表4)。而且，在六倍體小麥品種Cadenza中發(fā)現(xiàn)的各個TaALAD基因突變位點(diǎn)的數(shù)目都高于在四倍體小麥品種Kronos中發(fā)現(xiàn)的數(shù)目。

3 討 論

ALAD能夠催化兩個ALA分子縮合成膽色素原(porphobilinogen,PBG)，并進(jìn)一步在四吡咯化合物如維生素 B12、血紅素和葉綠素等許多生物分子的合成過程中起到不可替代的作用[2]。Takenouchi等[9]在普通小麥中克隆了3個 ALAD1>基因，超表達(dá) TaALAD1>基因的煙草表現(xiàn)出對除草劑的耐性，但該研究并未確定 TaALAD1基因在染色體上的具體位置。本研究利用中國春參考基因組信息，鑒定了6個TaALAD基因，其中 TaALAD-A1>、 TaALAD-B1>和 TaALAD-D1> 三個基因位于第七同源群染色體的長臂，BLAST結(jié)果顯示，這3個基因與Takenouchi等[9]研究的3個基因處在相同的物理區(qū)間，為相同的基因。

Tu：烏拉爾圖小麥；Ta：普通小麥；As：擬斯卑爾脫山羊草；At：粗山羊草?；疑幱氨硎颈Ｊ氐腁LAD結(jié)構(gòu)域。Tu:Triticum urartu; Ta:Triticum aestivum L.; Ae:Aegilops speltoides; At:Aegilops tauschii.Conserved ALAD domain is indicated in grey shading.

除了 TaALAD-1>基因，本研究還在第六同源群染色體的短臂上鑒定了3個 TaALAD-2>基因，而這3個基因在Takenouchi等[9]的研究中并沒有發(fā)現(xiàn)，可能是由于 TaALAD-2>在小麥各個組織的表達(dá)量相對較低。

普通小麥包含A、B和D基因組，模式植物擬南芥和水稻中的一個基因在普通小麥中一般都有3個同源基因[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)， TaALAD-1>和 TaALAD-2>基因都包含3個部分同源基因，但 TaALAD-1>基因在各個組織的表達(dá)量高于 TaALAD-2>(表2)，暗示在 TaALAD-1>基因可能在催化兩分子的ALA縮合成膽色素原中起主要作用，而 TaALAD-2>基因起次要作用。本研究還發(fā)現(xiàn)熱脅迫導(dǎo)致 TaALAD-1>的表達(dá)量的上調(diào)或下調(diào)，但熱脅迫對 TaALAD-2>的表達(dá)量影響都不大，這表明 TaALAD-1>基因可能在對抗熱脅迫中起到一定的作用。而且 TaALAD-1>和 TaALAD-2 的3個部分同源基因的表達(dá)量也存在一定的差異，這可能由于六倍體小麥的基因功能存在冗余，不同基因組來源的基因功能存在一定分化所致[17]。

圖2 植物ALAD基因的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of ALAD in plants

表2 普通小麥ALAD基因在不同時期各個組織的表達(dá)情況Table 2 Expression patterns of ALAD in common wheat at different stages

表3 普通小麥ALAD基因在逆境脅迫下的表達(dá)情況Table 3 Expression of ALAD genes in common wheat under different stresses

表4 小麥TILLING數(shù)據(jù)庫中ALAD基因的突變位點(diǎn)Table 4 Mutations of ALAD candidate genes present in the wheat TILLING libraries

在小麥完成基因組測序的背景下，突變體在小麥功能基因組研究中發(fā)揮了不可替代的作用[10]。Krasileva等[15]對四倍體小麥Kronos和六倍體小麥Cadenza的2 735個突變體進(jìn)行外顯子捕獲測序，構(gòu)建了小麥TILLING數(shù)據(jù)庫，而且對外提供突變體。Li 等[12]利用該小麥TILLING數(shù)據(jù)庫，鑒定了45個小麥產(chǎn)量基因的候選突變位點(diǎn)。在本研究中，6個小麥TaALAD基因都找到了數(shù)量不同的突變位點(diǎn)，其中一些突變位點(diǎn)為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)突變、無義突變、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)突變和剪切位點(diǎn)突變(表4)，這些突變位點(diǎn)很可能影響ALAD基因的功能，在后續(xù)TaALAD基因的功能解析中發(fā)揮重要的作用。