趙丹陽，朱 婷,王衛(wèi)東，張思妮，夏雪姣，翟曉光，丁 勤，馬翎健

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西楊陵 712100)

基因關(guān)聯(lián)分析是以連鎖不平衡為基礎(chǔ)，對自然群體中目標(biāo)性狀的遺傳變異與基因多樣性進(jìn)行關(guān)聯(lián)，篩選與表型變異相關(guān)分子標(biāo)記的一種策略，具有低耗費、高精度、強實用性等優(yōu)點，目前已廣泛應(yīng)用于水稻[1]、小麥[2]、玉米[3-6]、油菜[7]等作物遺傳育種研究。近年來，小麥的關(guān)聯(lián)分析研究主要圍繞株高、穗粒數(shù)、可育小穗數(shù)、千粒重等產(chǎn)量性狀進(jìn)行。如Wu等[8]對黃淮麥區(qū)175份小麥的株高、產(chǎn)量相關(guān)性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，從中篩選出23個顯著關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記。有研究發(fā)現(xiàn)，Xwmc134與小麥株高相關(guān)，在WMC363～Xgwm234之間含控制穗長的QTL位點，Xwmc710、Xbarc235和Xbarc252能以高頻率從親本遺傳于后代，且與穗粒數(shù)、產(chǎn)量緊密相關(guān)，Xubc873a～Xwmc63區(qū)間內(nèi)有與可育小穗數(shù)相關(guān)的QTL位點，Wmc48與粒重相關(guān)[9-13]。此外，Mir等[14]還發(fā)現(xiàn)了11個與小麥粒重關(guān)聯(lián)的新型分子標(biāo)記。但是，關(guān)于小麥株高、穗長、單株穗數(shù)、可育小穗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒重等多個重要產(chǎn)量性狀與分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析研究仍較少。

本研究主要以52份黃淮麥區(qū)小麥品種(系)為材料，對6個重要產(chǎn)量性狀進(jìn)行兩年多點表型鑒定，利用覆蓋小麥21條染色體全基因組的226個SSR標(biāo)記和22個SNP標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期為小麥產(chǎn)量性狀相關(guān)等位變異的鑒定挖掘及分子標(biāo)記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的52份小麥材料中，包括24個黃淮麥區(qū)主栽品種和28個西北農(nóng)林科技大學(xué)近期培育的小麥品系。其中，黃淮麥區(qū)主栽品種中，陜西有7個，河南有8個，山東有5個，河北有2個，安徽和江蘇各有1個(表1)。

1.2 表型鑒定

2015年將52份供試材料種植于陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)和河南南陽農(nóng)科院試驗站。2016年將供試材料分別種植于陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗站、江蘇宿遷中江種業(yè)育種基地與河南駐馬店農(nóng)科院試驗站。按照完全隨機區(qū)組設(shè)計，單行種植，行長、行距、株距分別為1.5 m、20 cm、10 cm，每行點播15粒種子，并進(jìn)行常規(guī)田間管理。2016年5月下旬于陜西楊凌、河南南陽和2017年5月下旬于陜西楊凌、河南駐馬店、安徽宿遷調(diào)查供試材料表型性狀。每地每個材料隨機選取5個單株測量其株高、穗長，并對單株穗數(shù)、可育小穗數(shù)及穗粒數(shù)進(jìn)行計數(shù)。收獲時每行隨機收取10個單穗，脫粒、烘干、去除碎粒后稱量得其千粒重。

1.3 標(biāo)記選擇及基因型鑒定

通過參考文獻(xiàn)和GrainGenes數(shù)據(jù)庫(http://avena.pw.usda.gov/GG2/index. shtml)篩選出覆蓋小麥全基因組的365對SSR引物，初篩后最終獲得226對多態(tài)性引物(A基因組55個，B基因組73個，D基因組98個)。通過查閱文獻(xiàn)和NCBI數(shù)據(jù)庫篩選89對SNP引物對供試小麥材料進(jìn)行KASP(kompetitive allele specific PCR)基因分型，篩選出多態(tài)性高的22對SNP引物(A基因組10個，B基因組5個，D基因組7個)。

2016年11月在陜西楊凌小麥育種中心實驗基地取小麥嫩葉，采用改良CTAB法[15]提取DNA，DNA提取液進(jìn)行質(zhì)控后稀釋備用。

SSR標(biāo)記鑒定步驟如下：(1)SSR實驗操作程序和PCR擴增參照簡化的SSR分析體系[16]操作；(2)擴增產(chǎn)物用6%非變性聚丙烯酞胺凝膠(polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)分離，以改進(jìn)的銀染方法[17]染色并于凝膠成像儀中觀察讀帶；(3)分析每對SSR引物膠圖，因為在150～300 kb間條帶多樣性豐富，從此區(qū)間讀取3條多態(tài)性帶，并按照軟件DataFormater“0，1”帶型格式[18]整理SSR信息。SNP標(biāo)記鑒定均參照AS-PCR[19]擴增及產(chǎn)物檢測的方法，用384孔板進(jìn)行高通量PCR，于微孔板熒光分析儀得到所需數(shù)據(jù)。由于SNP引物較少，且其分型結(jié)果與SSR 標(biāo)記格式不同，后續(xù)分析將其轉(zhuǎn)化為SSR的“0，1”格式進(jìn)行軟件分析。

表1 試驗材料編號及其來源Table 1 Origin and name of the tested materials

1.4 數(shù)據(jù)分析

運用SPSS 22.0對表型數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計分析和方差分析，作出5種環(huán)境的表型分析表。通過DataFormater軟件將，標(biāo)記的“0，1”帶型轉(zhuǎn)為“bp”帶型及其他分子遺傳學(xué)軟件可導(dǎo)入的格式。利用Powermarker 進(jìn)行遺傳多樣性分析，獲得每個分子標(biāo)記的基因多樣性指數(shù)、等位變異豐富度及多態(tài)性信息含量(polymorphism information content,PIC)等信息。并進(jìn)行UPGMA聚類分析，結(jié)合iTOL(http://itol.embl.de/)網(wǎng)站進(jìn)行聚類圖的繪制與修飾。通過NTsys軟件分析獲得供試材料的親緣關(guān)系矩陣，并進(jìn)行親緣關(guān)系聚類熱圖繪制，并與UPGMA聚類結(jié)果進(jìn)行比對。運用Structure 軟件估計52份材料的群體結(jié)構(gòu)，基于貝葉斯方法得到每個材料對應(yīng)的Q值，將52份材料劃分為不同的亞群，繪制群體遺傳結(jié)構(gòu)圖。

1.5 全基因組關(guān)聯(lián)分析及優(yōu)異等位變異的發(fā)掘

基于供試材料表型數(shù)據(jù)分析與分子標(biāo)記遺傳多樣性、聚類、親緣關(guān)系及群體結(jié)構(gòu)分析，利用獲得的表型數(shù)據(jù)、群體Q值、親緣關(guān)系Kinship值、標(biāo)記帶型等與TASSEL 3.0 軟件結(jié)合其混合線性模型(multilevel linear model， MLM)進(jìn)行表型性狀與標(biāo)記間的關(guān)聯(lián)分析。通過關(guān)聯(lián)分析獲得關(guān)聯(lián)位點，進(jìn)行優(yōu)異等位基因的發(fā)掘并計算在P<1/N時對標(biāo)記位點表型變異的解釋率(R2)。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型統(tǒng)計結(jié)果分析

描述性統(tǒng)計分析(表2)表明，不同地區(qū)間、性狀間小麥兩年表型性狀差別均較大。在地區(qū)間，產(chǎn)量由河南、安徽、陜西依次遞減，6個重要產(chǎn)量性狀的這種趨勢基本一致；在性狀間，穗長和單株穂數(shù)的變異系數(shù)最大，可育小穗數(shù)和穗粒數(shù)次之，千粒重和株高的變異系數(shù)最小。方差分析(表3)表明，6個性狀在不同地區(qū)間和材料間均存在顯著或極顯著差異，說明這些小麥性狀受環(huán)境和遺傳因素影響均較大。

表2 供試群體6個產(chǎn)量性狀表型的描述性統(tǒng)計分析Table 2 Descriptive statistics of six yield traits of 52 wheat accessions

表3 52個小麥品種(系)6個性狀兩年表型數(shù)據(jù)方差分析Table 3 ANOVA for six phenotypic traits in 52 wheat varieties(lines) observed in two years

2.2 標(biāo)記遺傳多樣性結(jié)果分析

利用均勻分布于小麥21條染色體上的248個分子標(biāo)記，在52份小麥材料中共檢測到899個等位變異(表4與圖1)，每個位點平均檢測到3.625個等位變異，變化范圍為1～5。遺傳多樣性指數(shù)的變化范圍為0.301～0.715，平均值為0.586，其最大和最小值的分子標(biāo)記分別是gwm635和barc204；多態(tài)性信息含量(PIC)變化范圍為0.280～0.666，平均值為0.510，達(dá)到高度多態(tài)的水平(PIC≥0.5)，PIC最大和最小值的分子標(biāo)記分別為gwm635和barc204。在基因組水平上，B染色體組的等位變異總數(shù)和平均等位變異豐富度均最高，D染色體組次之，A染色體組最低；A染色體組的遺傳多樣性指數(shù)和多態(tài)性信息含量(PIC值)最高，B染色體組中等，D染色體組最低。

表4 248個標(biāo)記在供試小麥群體基因組水平上的遺傳多樣性分析Table 4 Genetic diversity analysis among genome in 52 wheat accessions

圖1 等位變異數(shù)與遺傳多樣性指數(shù)(GI)和多態(tài)性信息含量(PIC)的散點圖Fig.1 Scatter plot of allele number，gene diversity(GI) and PIC

2.3 供試材料群體結(jié)構(gòu)結(jié)果分析

利用Structure 2.3.4軟件分析，得到52份小麥材料群體結(jié)構(gòu)Q值與極大似然值LnP(D)，由LnP(D)計算不同K值間的ΔK來確定最佳K值(圖2)。當(dāng)K=4時，LnP(D)改變平滑趨勢且ΔK曲線具有明顯的拐點，即52個材料被劃分為4個亞群(圖3)，4個亞群所含品種數(shù)分別為12、24、7、9，占總材料數(shù)的比例分別為23.1%、46.1%、13.5%和17.3%。分群結(jié)果表明，各類群中材料與品種(系)育成時間及地理來源不完全相關(guān)。

通過比較UPGMA聚類結(jié)果(圖4)與利用NTsys得到的親緣關(guān)系(圖5)，所得群體遺傳結(jié)構(gòu)分類結(jié)果基本一致，也將群體基本劃分為4個亞群，2種分類方法所劃分的亞群中，僅編號為20、32、33、42的4個品種(系)分群有差異。

2.4 全基因組關(guān)聯(lián)定位

經(jīng)關(guān)聯(lián)分析，在兩年多點共5種環(huán)境下，與供試材料的株高、穗長、單株穗數(shù)、可育小穗數(shù)、穗粒數(shù)及千粒重顯著關(guān)聯(lián)的位點有13個，表型變異解釋率(R2)為6.74%～82.71%(表5)。與株高、穗粒數(shù)、千粒重關(guān)聯(lián)的位點各有1個，分別位于3A、4A、7D染色體上；與穗長關(guān)聯(lián)的位點有5個，其中位于A、B染色體組的位點各2個，位于D染色體組的位點1個；與單株穂數(shù)關(guān)聯(lián)的位點有5個，其中位于A染色體組3個，位于D染色體組的位點有2個；與可育小穗數(shù)關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記有3個，其中位于B染色體組的標(biāo)記2個，D染色體組的標(biāo)記1個。其中分子標(biāo)記xwmc580、xwmc181與穗長、單株穗數(shù)均顯著關(guān)聯(lián)，貢獻(xiàn)率最高的分子標(biāo)記為wmc331。與產(chǎn)量性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記及其引物序列已列出以供參考(表6)。

圖2 LnP(D)、ΔK估算群體結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Estimation of population structure by the likelihood distribution and delta K values(ΔK)

圖3 利用 Structure 軟件對供試材料的群體遺傳結(jié)構(gòu)Fig.3 Population structure(K=4) of materials by Structure software

圖4 52份供試小麥材料聚類圖Fig.4 Dendrogram of 52 wheat accessions by UPGMA cluster analysis

圖5 52份供試小麥材料親緣關(guān)系聚類熱圖Fig.5 Image clustering of 52 wheat accessions by Kingship analysis

表5 與產(chǎn)量性狀顯著相關(guān)的標(biāo)記位點Table 5 SSR loci significantly associated with yield-related traits in wheat

表6 所得顯著關(guān)聯(lián)SNP標(biāo)記及其引物序列Table 6 SNP loci and primer sequences significantly associated with yield-related traits in wheat

3 討 論

在遺傳多樣性評價體系中，平均等位變異豐富度、基因遺傳多樣性、多態(tài)性信息含量均被普遍應(yīng)用[20]。本試驗所選分子標(biāo)記平均等位變異豐富度分布(B>D>A)和遺傳多樣性指數(shù)與多態(tài)性信息含量分布(A>B>D)不同，且與人們普遍認(rèn)為的小麥基因組遺傳多樣性B>A>D有所差異。究其原因，一方面可能由于分子標(biāo)記只是一段較短DNA序列，不能代表所有基因在染色體上的分布特征，當(dāng)所用標(biāo)記數(shù)量不同時，分析結(jié)果可能不同[21]。如李 遠(yuǎn)等[22]用86對與趙 檀等[21]用231對多態(tài)性SSR引物對相同小麥材料遺傳多樣性的分析結(jié)果差異明顯。另一方面，本研究的試驗群體較小，且多為陜西省培育的小麥品種(系)，可能存在部分基因座，盡管等位變異較少，但其PIC值仍然很高，即引物的多態(tài)性信息含量高，其等位變異位點不一定多。趙 檀等[21]、ZHANG等[23]研究認(rèn)為，評價種質(zhì)資源遺傳多樣性不能僅僅用平均等位變異豐富度或基因多樣性、多態(tài)性信息含量作為評判標(biāo)準(zhǔn)，而有必要對各指標(biāo)進(jìn)行權(quán)衡。 因此，本研究初步認(rèn)為，由 52個黃淮麥區(qū)小麥品種(系)組成的試驗群體，其遺傳多樣性水平在三個染色體組間沒有明顯差異。

本試驗將52份供試材料分為4個亞群，此分群結(jié)果表明各類群中材料與品種(系)育成時間及地理來源不完全相關(guān)，分析其原因可能是黃淮麥區(qū)生態(tài)條件較為相似，育種材料共享力度加大，常用骨干親本有限，導(dǎo)致了黃淮麥區(qū)品種(系)間親緣關(guān)系較近，遺傳多樣性降低。今后，育種工作應(yīng)重視擴大引進(jìn)與利用國外資源，挖掘中國豐富的地方種質(zhì)資源，不斷拓寬改造中國小麥的遺傳基礎(chǔ)。

本研究中與穗長、單株穗數(shù)均顯著相關(guān)的標(biāo)記為xwmc181、xwmc580。要燕杰等[24]發(fā)現(xiàn)，xwmc580與8個品質(zhì)和產(chǎn)量性狀在0.01水平上顯著相關(guān)，且其被推測與較好綜合農(nóng)藝性狀[25]有關(guān)聯(lián)，在長穗偃麥草研究及小麥遺傳改良中有重要利用價值，這與本研究結(jié)果一致。xwmc181被定位到2DL，且與小麥黃花葉病毒的抗性相關(guān)[26]。此標(biāo)記也與直立和下披旗葉性狀連鎖[27]。本試驗中與穗長顯著相關(guān)的標(biāo)記還有xwmc719，其與水稻植株的矮化性狀關(guān)聯(lián)[28]，也與小麥抗條銹病性狀[29-30]緊密連鎖。gwm296、barc178和xwmc331與可育小穗數(shù)顯著相關(guān)。在這三個分子標(biāo)記中，barc178與小麥花前持續(xù)時間呈正相關(guān)[31]，結(jié)合本試驗檢測結(jié)果，推測該區(qū)段基因可能與小麥開花期發(fā)育相關(guān)；gwm296不僅與雌性不育小麥XND126育性基因連鎖[32]，還與植株的抗葉銹病基因 Lr22a>緊密連鎖[33]，與抗葉銹病基因 LrSV1>關(guān)聯(lián)[34]；xwmc331被定位于4D染色體42.9 cM處[35]，其與耐鋁[36]、抗赤霉病[37]等性狀相關(guān)聯(lián)，是用于小麥育種輔助選擇優(yōu)良分子標(biāo)記。與千粒重顯著相關(guān)標(biāo)記gwm44位于7DS上，是識別小麥持久抗條銹病基因 Yr18>關(guān)聯(lián)的候選標(biāo)記[38]。綜上所述，本試驗中與產(chǎn)量性狀顯著關(guān)聯(lián)位點與前人利用 SSR、QTL等定位位點的位置相同或接近，但所關(guān)聯(lián)性狀有所不同。

作為第三代分子標(biāo)記，SNPs的缺失率明顯低于SSRs，SNP具有穩(wěn)定遺傳、高效、快捷的特點[39]。本試驗綜合兩者，用226個微衛(wèi)星標(biāo)記與22個SNP標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性及關(guān)聯(lián)分析，其結(jié)果更為可信。已有研究表明,在關(guān)聯(lián)分析中同時使用Q值(群體結(jié)構(gòu)信息)和Kinship值(品種間親緣關(guān)系)的MLM(Q+K)模型優(yōu)于單獨使用Q值或Kinship值的GLM(Q)和MLM(K)模型[40-41]。 為了提高所關(guān)聯(lián)標(biāo)記的可靠性，本研究對基因型數(shù)據(jù)采用了Tassel軟件中的混合線性模型MLM(Q+K)進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)的分析，最終獲得顯著關(guān)聯(lián)的13個分子標(biāo)記，這些優(yōu)異等位基因有待進(jìn)一步的精確定位，可為后續(xù)相關(guān)性狀基因的關(guān)聯(lián)定位提供依據(jù)。