王 磊,施文瑞,宋東鎣,李學(xué)軍,樊云鵬,高興磊,張 紅
( 河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453007 )
2017年中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒顯示我國淡水觀賞魚養(yǎng)殖量在2016年約4×109尾[1]。隨著現(xiàn)代社會(huì)人們生活水平的提高,越來越多的人開始關(guān)注觀賞魚市場,觀賞魚具有廣闊的市場前景。草金魚(Carassiusauratus)是我國傳統(tǒng)的觀賞魚養(yǎng)殖品種,俗稱紅鯽魚或金鯽魚,體形近似鯽魚(C.auratus),屬魚綱、鯉形目、鯉科、鯽屬,具有很好的觀賞價(jià)值及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前有關(guān)草金魚的研究主要為不同因素對其生長發(fā)育的影響研究[2-3]、分子生物學(xué)研究[4]和體色研究[5-7]等,對草金魚的早期生活史的研究較少。本研究擬通過對草金魚的胚胎發(fā)育及胚后發(fā)育過程系統(tǒng)的觀察,對胚胎發(fā)育及胚后發(fā)育特征的拍照記錄,以期揭示草金魚早期發(fā)育的規(guī)律,從而為草金魚的人工繁殖和遺傳育種等工作提供一定依據(jù)。
2016年6月采用河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地的草金魚親魚,進(jìn)行人工催產(chǎn)后獲得受精卵,受精卵置于水盆中的培養(yǎng)皿里進(jìn)行孵化,孵化用水事先進(jìn)行曝氣,水溫為(23±1) ℃。
幼魚的培育在河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地的養(yǎng)殖桶中進(jìn)行,初孵仔魚培育溫度為19~22 ℃。卵黃囊消失后,每日8:00將飼料用水捏成團(tuán),裝入料兜進(jìn)行投喂。投喂期間,按照每日均有少量剩余為宜。每日8:00和17:00各換水1次,每次換水深度約10 cm,同時(shí)挑出死魚。
胚胎發(fā)育過程中,將受精卵至卵裂期觀察時(shí)間間隔設(shè)為0.083~0.17 h,囊胚期至器官形成期觀察間隔設(shè)為0.17~1 h,出膜前期至出膜期觀察間隔為2 h。每次取10粒受精卵,在加水培養(yǎng)皿中采用奧特連續(xù)變倍體視顯微鏡(SZ680T2L)對胚胎發(fā)育情況進(jìn)行拍照記錄,以50%的個(gè)體出現(xiàn)新特征作為劃分發(fā)育時(shí)期的標(biāo)準(zhǔn)。
仔魚、稚魚及幼魚觀察:草金魚出膜后,每日20:00取樣10尾,觀察其外部形態(tài)變化,拍照并記錄其長度,直至鱗片完全長出。
草金魚成熟卵子為黏性、圓形。草金魚受精卵(圖1a)在曝氣的自來水中進(jìn)行孵化,水溫(23±1) ℃,約56.67 h后完成整個(gè)胚胎發(fā)育,開始進(jìn)入胚后發(fā)育。草金魚的胚胎發(fā)育可分為胎盤期、卵裂期、囊胚期、原腸期、神經(jīng)胚期、肌節(jié)出現(xiàn)及尾泡期、器官形成期及出膜期(表1)。
2.1.1 胚盤期
成熟卵子呈淡黃綠色、圓形,卵質(zhì)分布均勻。卵子受精后遇水膨脹,卵周間隙擴(kuò)大。受精后1.13 h,原生質(zhì)向動(dòng)物極聚集,逐漸隆起形成胚盤(圖1b)。
表1 草金魚胚胎發(fā)育時(shí)程
2.1.2 卵裂期
受精后1.30 h,受精卵動(dòng)物極胚盤中央出現(xiàn)分裂溝,胚盤分裂為相似的2個(gè)細(xì)胞,即2細(xì)胞期(圖1c);受精后1.47 h,沿第一次分裂垂直的方向出現(xiàn)第二次卵裂,形成4個(gè)大小相同的細(xì)胞,即4細(xì)胞期(圖1d);受精后1.57 h,胚盤進(jìn)行第三次分裂,形成8個(gè)分裂球,進(jìn)入8細(xì)胞期(圖1e);1.80 h后進(jìn)入16細(xì)胞期(圖1f),2.30 h后進(jìn)入32細(xì)胞期(圖1g),受精后2.60 h,卵裂向多個(gè)方向進(jìn)行,細(xì)胞數(shù)量逐漸增多,細(xì)胞越來越不規(guī)則,界面難以區(qū)分,進(jìn)入多細(xì)胞期(圖1h)。
2.1.3 囊胚期
草金魚受精后3.50 h細(xì)胞進(jìn)一步分裂,細(xì)胞堆積在動(dòng)物極半球,胚盤高聳于卵黃上方,占卵體積的1/2,進(jìn)入囊胚早期(圖1i);受精后3.67 h,胚盤細(xì)胞繼續(xù)分裂,細(xì)胞向下方擴(kuò)展,囊胚層較囊胚早期低,即為囊胚中期(圖1j);受精后4.92 h,囊胚層沿卵表面向植物極擴(kuò)展,開始產(chǎn)生下包作用,囊胚層變得扁平,即囊胚晚期(圖1k)。
2.1.4 原腸期
草金魚受精后7.73 h,進(jìn)入原腸期。囊胚層細(xì)胞繼續(xù)下包卵黃1/3進(jìn)入原腸早期(圖1l);受精后8.92 h,囊胚層細(xì)胞下包卵黃1/2,進(jìn)入原腸中期(圖1m);受精后10.57 h,囊胚下包卵黃2/3,進(jìn)入原腸晚期(圖1n)。
2.1.5 神經(jīng)胚期
草金魚受精后10.80 h,囊胚細(xì)胞繼續(xù)下包卵黃至4/5,過程中細(xì)胞數(shù)量不斷增加,進(jìn)入神經(jīng)胚期(圖1o);受精后12.02 h,胚孔閉合,卵黃被完全包裹,進(jìn)入胚孔閉合期(圖1p)。
2.1.6 肌節(jié)出現(xiàn)及尾泡期
草金魚受精后14.20 h,胚孔封閉后軀干中段出現(xiàn)兩段肌節(jié),即肌節(jié)出現(xiàn)期(圖1q);受精后14.95 h,胚體尾部出現(xiàn)圓形亮點(diǎn)即尾泡,即入尾泡形成期(圖1r)。
2.1.7 器官形成期
草金魚受精后15.53 h,進(jìn)入器官形成期,可看到腦的前段出現(xiàn)透明囊泡即眼囊,進(jìn)入眼囊期(圖1s);受精后17.50 h,在眼囊下方可觀察到暗色斑塊狀嗅囊,進(jìn)入嗅囊出現(xiàn)期(圖1t);受精后17.78 h,出現(xiàn)錐形尾芽,進(jìn)入尾芽出現(xiàn)期(圖1u);受精后19.17 h,出現(xiàn)透明的泡狀耳囊,進(jìn)入耳囊形成期(圖1v);受精后22.50 h,可觀察到多對肌節(jié),肌體的中段出現(xiàn)不連續(xù)性的肌肉收縮,進(jìn)入肌肉效應(yīng)期(圖1w);受精后28.67 h,心臟原基開始有節(jié)律的跳動(dòng),進(jìn)入心跳期(圖1x)。
2.1.8 出膜期
受精后54.58 h,尾部清晰可見,可清晰看見頭部,進(jìn)入出膜前期(圖1y);受精后56.67 h,胚體扭動(dòng)劇烈,開始破膜而出,完全破膜,進(jìn)入出膜后期(圖1z)。
2.2.1 卵黃囊期仔魚
初孵仔魚:剛出膜的仔魚,附帶有卵黃囊,全長(4.48±0.30) mm,卵黃囊長(2.0±0.70) mm,卵黃囊膨大透明,緊貼魚體,卵黃囊約占全長的1/2,初孵仔魚靠卵黃囊中的營養(yǎng)物質(zhì)生長,初孵仔魚背部及卵黃囊上均有黑色素細(xì)胞分布,眼部清晰可見。
圖1 草金魚胚胎發(fā)育分期a. 受精卵; b. 胚盤形成; c. 2細(xì)胞期; d. 4細(xì)胞期; e . 8細(xì)胞期; f. 16細(xì)胞期; g. 32細(xì)胞期; h. 多細(xì)胞期; i. 囊胚早期; j. 囊胚中期; k. 囊胚晚期; l. 原腸早期; m. 原腸中期; n. 原腸晚期; o. 神經(jīng)胚期; p. 胚孔封閉期; q. 肌節(jié)出現(xiàn)期, →.示肌節(jié); r. 尾泡形成期, →.示尾泡; s. 眼囊出現(xiàn)期, →.示眼囊; t. 嗅囊出現(xiàn)期, →. 示嗅囊; u. 尾芽出現(xiàn)期, →. 示尾芽; v.耳囊出現(xiàn)期, →.示耳囊; w. 肌肉效應(yīng)期, →. 示肌節(jié); x. 心跳期, →.示心臟; y. 出膜前期, →.示眼部; z. 出膜期, 上方→. 示色素;下方→. 示卵黃囊.
出膜后1 d:仔魚身體伸長,卵黃囊已縮小成前端膨大,后端細(xì)長的囊。背部及卵黃囊上黑色素細(xì)胞增多,尾柄處有鰭條出現(xiàn)(圖2a)。
出膜后2 d:卵黃囊明顯變小,頭部及至全身背側(cè)皮膚出現(xiàn)黃色素細(xì)胞。仔魚卵黃囊中出現(xiàn)空泡,有吞食跡象(圖2b)。
出膜后3 d:頭部及背部色素繼續(xù)沉積,心臟色素明顯沉積,卵黃囊繼續(xù)縮小成細(xì)棒狀,平衡能力及游泳能力增強(qiáng)(圖2c)。
出膜后4 d:卵黃囊基本吸收完畢,后端呈針狀,縮小明顯。腸道中開始出現(xiàn)異物顆粒,眼已能不斷轉(zhuǎn)動(dòng),下頜形成并可動(dòng)(圖2d)。
出膜后5 d:仔魚的卵黃囊已耗盡,進(jìn)入外源性
圖2 草金魚胚胎后期發(fā)育分期a. 出膜后1 d, a1.示卵黃囊上黑色素, a2.示卵黃囊; b. 出膜后2 d, b1.示黃色素; c.出膜后3 d; d. 出膜后4 d, d1.示眼部, d2.示黃色素e. 出膜后5 d, e1.示魚鰾; f. 出膜后6 d, f1.示背部圓點(diǎn)狀黃色素; g. 出膜后7 d, g1.示吻部, g2.示腸道內(nèi)食物; h. 出膜后8 d; i. 出膜后9 d, i1.示峽部; j. 出膜后10 d, j1.示心臟; k. 出膜后12 d; l. 出膜后13 d; m. 出膜后15 d, m1.示鰾二室, m2.示尾鰭; n. 出膜后17 d, n1.示背鰭; o. 出膜后19 d; p. 出膜后21 d, p1.示鰓部; q. 出膜后25 d, q1.示背鰭, q2.示臀鰭; r. 出膜后34 d, r1.示鱗片; s. 出膜后36 d, s1.示鰓蓋, t. 出膜后38 d, t1.示胸鰭; u. 出膜后44 d.
營養(yǎng)階段,開始自由游動(dòng)與攝食。黑色素沉積明顯,清晰可見,眼睛明顯。魚鰾中已充滿氣體,其輪廓清楚(圖2e)。
2.2.2 晚期仔魚
出膜后6 d:黑色素繼續(xù)沉積,頭部背面的黑色素細(xì)胞收縮成圓點(diǎn)狀而不成分枝狀(圖2f)。
出膜后7 d:消化道前端膨大,后端漸細(xì),直通肛門,消化道中充滿食物,有排泄物排出,吻部有黑色素細(xì)胞出現(xiàn)(圖2g)。
出膜后8 d:魚體伸長,吻部黑色素細(xì)胞增多,體背黑色素細(xì)胞及黃色素細(xì)胞繼續(xù)沉積(圖2h)。
出膜后9 d:腸道為直形,有大量排泄物排出,鰓蓋膜可動(dòng),仔魚的下頜不斷運(yùn)動(dòng)(圖2i)。
出膜后10 d:鰓蓋膜已完全遮蓋了鰓,尾鰭基部形成了黑色素細(xì)胞和黃色素細(xì)胞的堆積(圖2j)。
出膜后12 d:頭部黑色素細(xì)胞及黃色素細(xì)胞繼續(xù)沉積,脊索末端彎向上方,尾鰭中形成了間質(zhì)的堆積(圖2k)。
出膜后13 d:頭部收縮成圓點(diǎn)狀的黑色素細(xì)胞增多且增大,吻部黑色素細(xì)胞繼續(xù)堆積,尾鰭的間質(zhì)開始形成了骨質(zhì)鰭條(圖2l)。
出膜后15 d:仔魚鰾的中部有從中部內(nèi)縊分為兩室的趨勢,鰾表面的黑色素細(xì)胞增多,進(jìn)入鰾分二室期,可以清晰看見草金魚的尾鰭為深叉形(圖2m)。
出膜后17 d:體型增大,背鰭可見,消化道進(jìn)一步增大,魚體呈半透明狀態(tài),眼珠大而有光澤(圖2n)。
出膜后19 d:頭部及體背色素細(xì)胞進(jìn)一步沉積,魚鰾二室明顯,消化道充滿體內(nèi)多部分,吞食顆粒有明顯消化現(xiàn)象(圖2o)。
出膜后21 d:背鰭明顯,臀鰭可見,尾鰭繼續(xù)增大,色素沉積明顯,魚鰓清晰可見,游動(dòng)迅速,鰓部血紅色明顯(圖2p)。
出膜后25 d:背鰭與臀鰭均清晰可見,尾鰭繼續(xù)變大變厚,體背及頭部黑色素細(xì)胞收縮成圓點(diǎn)狀并排列緊密,吻部有圓點(diǎn)狀黑色素出現(xiàn),魚體半透明部位減少(圖2q)。
2.2.3 稚魚階段
出膜后34 d:背鰭與腹鰭進(jìn)一步增大,開始有鱗片出現(xiàn),半透明部位基本消失(圖2r)。
出膜后36 d:體色進(jìn)一步變化,半透明部位已大部分消失,吻部明顯,游動(dòng)敏捷(圖2s)。
出膜后38 d:稚魚已基本具有成魚外形,胸鰭清晰可見,此時(shí)魚體顏色大部分呈現(xiàn)灰色,鱗片進(jìn)一步增長,尾鰭大而分叉,鰓蓋張合明顯(圖2t)。
出膜后44 d:大部分魚體體色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色,身體透明特征消失,稚魚階段發(fā)育完成進(jìn)入幼魚期,此時(shí)平均全長達(dá)(24.08±2.56) mm,其外部形態(tài)及生活習(xí)性均與成魚相似(圖2u)。
近年來,對于魚類的胚胎發(fā)育研究主要集中在一些經(jīng)濟(jì)魚類及珍稀魚類中[8-9],對于觀賞魚的胚胎及胚后發(fā)育研究較少。金魚是重要的觀賞魚種之一,養(yǎng)殖歷史可追溯到約1000年前[10],其有著獨(dú)特的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及研究價(jià)值,例如金魚易得且一次能夠產(chǎn)下大量卵子,其胚胎較多的應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)研究[11-13],因此對草金魚的胚胎及胚后發(fā)育進(jìn)行觀察研究有著重要的生物學(xué)意義。目前通常將魚類的早期生活史階段劃分為卵(胚胎)、仔魚及稚魚3個(gè)基本發(fā)育期[14]。在魚類早期生活史劃分的研究中,存在許多不同的觀點(diǎn)及不同的標(biāo)準(zhǔn)[15-17],本研究采用“孵化”作為卵和仔魚期的劃分界限。
與其他鯉科魚類一樣,草金魚受精卵的整個(gè)胚胎發(fā)育過程分為7個(gè)發(fā)育階段,包括卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期和器官形成期等,共歷時(shí)56.67 h。20世紀(jì)中期,李璞等[18]對金魚及鯽魚的胚胎發(fā)育分期進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)它們之間基本上是相似的,可以代表典型的硬骨魚類發(fā)育過程。Tsai等[19]研究發(fā)現(xiàn),普通金魚和斑馬魚(Daniorerio)這兩種硬骨魚類胚胎發(fā)育過程中整體形態(tài)特征十分相似,可將成熟的斑馬魚分子生物學(xué)技術(shù)用于金魚胚胎研究,可以進(jìn)一步研究馴化與發(fā)育的進(jìn)化關(guān)系。由于繁殖條件及種屬的不同,不同魚類胚胎發(fā)育所耗時(shí)間也不盡相同,其中在相同溫度下(23.0±1.0) ℃草金魚孵化時(shí)間略小于銀鯽(C.auratusgibelio)與普通鯽魚[20],滇池高背鯽(C.auratus)受精卵在水溫 12.9~15.0 ℃下,歷時(shí)174.88 h孵化[21],在斑鱖(Sinipercascherzeri)[22]、中華倒刺鲃(Spinibarbussinensis)[23]等魚類中,溫度也會(huì)影響胚胎發(fā)育進(jìn)程。
草金魚受精卵經(jīng)56.67 h后孵化,初孵仔魚培育溫度為19~22 ℃,出膜后4 d卵黃囊基本消失,5 d卵黃囊耗盡。鯉科魚類馬口魚 (Opsariichthysbidens)在26~28 ℃水溫下,經(jīng)108 h孵化后,卵黃囊消耗殆盡[24];鯉科魚類唐魚(Tanichthysalbonubes)[25]在水溫23~29 ℃時(shí),初孵仔魚5 d卵黃耗盡;鯉科魚類中華倒刺鲃[26]在水溫21.5~28 ℃條件下,6 d卵黃囊耗盡。卵黃囊期持續(xù)時(shí)間的長短受多因素影響,最主要的影響因素為溫度,溫度越高,卵黃囊消失越快,另外,營養(yǎng)(攝食)也是影響魚類生長的一個(gè)重要因素[27]。史先武等[28]研究發(fā)現(xiàn),水溫保持在19~22 ℃時(shí),長尾紅草金魚卵黃囊4 d基本消失;張國真等[29]研究發(fā)現(xiàn),水溫約20 ℃時(shí),草金魚卵黃囊3 d基本消失,本研究結(jié)果與前者的研究結(jié)果相同,而與后者研究的卵黃囊消失時(shí)間不同,這可能是由于本研究與前者的研究條件類似。草金魚孵化5 d后卵黃囊完全消失,進(jìn)入外源性營養(yǎng)階段,開始攝食,這與唐魚[25]、齊口裂腹魚(Scizothoraxprenanti)[30]開始覓食的時(shí)間相同。許多魚類的仔魚在由內(nèi)源性營養(yǎng)轉(zhuǎn)化到外源性營養(yǎng)的過渡階段常會(huì)出現(xiàn)大量死亡,其原因受多因素影響,但能否及時(shí)補(bǔ)充外源性營養(yǎng)是一重要影響因素[31]。
通過研究發(fā)現(xiàn)草金魚受精卵為黃綠色,呈卵圓形,在水溫(23.0±1.0) ℃下,歷時(shí)56.67 h完成整個(gè)胚胎發(fā)育過程。胚后發(fā)育可分為仔魚期、稚魚期和幼魚期。其中仔魚期又可分為卵黃囊仔魚期和后期仔魚,在水溫19~22 ℃的條件下,出膜后5 d,卵黃囊吸收完畢,卵黃囊仔魚期結(jié)束,進(jìn)入后期仔魚階段。培育至34日齡,開始出現(xiàn)鱗片,標(biāo)志后期仔魚發(fā)育完成,進(jìn)入稚魚期,在44日齡時(shí),鱗片生長完全,身體透明特征消失,稚魚階段發(fā)育完成,進(jìn)入幼魚期。在胚胎及胚后發(fā)育過程中,溫度對其發(fā)育速度影響很大,因此在進(jìn)行研究和繁殖實(shí)踐中要嚴(yán)格控制孵化和培育溫度。