王 磊，施文瑞，宋東鎣，李學(xué)軍，樊云鵬，高興磊，張 紅

( 河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007 )

2017年中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒顯示我國淡水觀賞魚養(yǎng)殖量在2016年約4×109尾[1]。隨著現(xiàn)代社會人們生活水平的提高，越來越多的人開始關(guān)注觀賞魚市場，觀賞魚具有廣闊的市場前景。草金魚(Carassiusauratus)是我國傳統(tǒng)的觀賞魚養(yǎng)殖品種，俗稱紅鯽魚或金鯽魚，體形近似鯽魚(C.auratus)，屬魚綱、鯉形目、鯉科、鯽屬，具有很好的觀賞價值及經(jīng)濟價值。目前有關(guān)草金魚的研究主要為不同因素對其生長發(fā)育的影響研究[2-3]、分子生物學(xué)研究[4]和體色研究[5-7]等，對草金魚的早期生活史的研究較少。本研究擬通過對草金魚的胚胎發(fā)育及胚后發(fā)育過程系統(tǒng)的觀察，對胚胎發(fā)育及胚后發(fā)育特征的拍照記錄，以期揭示草金魚早期發(fā)育的規(guī)律，從而為草金魚的人工繁殖和遺傳育種等工作提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 人工授精

2016年6月采用河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地的草金魚親魚，進行人工催產(chǎn)后獲得受精卵，受精卵置于水盆中的培養(yǎng)皿里進行孵化，孵化用水事先進行曝氣，水溫為(23±1) ℃。

1.2 幼魚培育

幼魚的培育在河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地的養(yǎng)殖桶中進行，初孵仔魚培育溫度為19～22 ℃。卵黃囊消失后，每日8：00將飼料用水捏成團，裝入料兜進行投喂。投喂期間，按照每日均有少量剩余為宜。每日8:00和17:00各換水1次，每次換水深度約10 cm，同時挑出死魚。

1.3 取樣和觀察

胚胎發(fā)育過程中，將受精卵至卵裂期觀察時間間隔設(shè)為0.083～0.17 h，囊胚期至器官形成期觀察間隔設(shè)為0.17～1 h，出膜前期至出膜期觀察間隔為2 h。每次取10粒受精卵，在加水培養(yǎng)皿中采用奧特連續(xù)變倍體視顯微鏡(SZ680T2L)對胚胎發(fā)育情況進行拍照記錄，以50%的個體出現(xiàn)新特征作為劃分發(fā)育時期的標準。

仔魚、稚魚及幼魚觀察：草金魚出膜后，每日20:00取樣10尾，觀察其外部形態(tài)變化，拍照并記錄其長度，直至鱗片完全長出。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚胎發(fā)育

草金魚成熟卵子為黏性、圓形。草金魚受精卵(圖1a)在曝氣的自來水中進行孵化，水溫(23±1) ℃，約56.67 h后完成整個胚胎發(fā)育，開始進入胚后發(fā)育。草金魚的胚胎發(fā)育可分為胎盤期、卵裂期、囊胚期、原腸期、神經(jīng)胚期、肌節(jié)出現(xiàn)及尾泡期、器官形成期及出膜期(表1)。

2.1.1 胚盤期

成熟卵子呈淡黃綠色、圓形，卵質(zhì)分布均勻。卵子受精后遇水膨脹，卵周間隙擴大。受精后1.13 h，原生質(zhì)向動物極聚集，逐漸隆起形成胚盤(圖1b)。

表1 草金魚胚胎發(fā)育時程

2.1.2 卵裂期

受精后1.30 h，受精卵動物極胚盤中央出現(xiàn)分裂溝，胚盤分裂為相似的2個細胞，即2細胞期(圖1c)；受精后1.47 h，沿第一次分裂垂直的方向出現(xiàn)第二次卵裂，形成4個大小相同的細胞，即4細胞期(圖1d)；受精后1.57 h，胚盤進行第三次分裂，形成8個分裂球，進入8細胞期(圖1e)；1.80 h后進入16細胞期(圖1f)，2.30 h后進入32細胞期(圖1g)，受精后2.60 h，卵裂向多個方向進行，細胞數(shù)量逐漸增多，細胞越來越不規(guī)則，界面難以區(qū)分，進入多細胞期(圖1h)。

2.1.3 囊胚期

草金魚受精后3.50 h細胞進一步分裂，細胞堆積在動物極半球，胚盤高聳于卵黃上方，占卵體積的1/2，進入囊胚早期(圖1i)；受精后3.67 h，胚盤細胞繼續(xù)分裂，細胞向下方擴展，囊胚層較囊胚早期低，即為囊胚中期(圖1j)；受精后4.92 h，囊胚層沿卵表面向植物極擴展，開始產(chǎn)生下包作用，囊胚層變得扁平，即囊胚晚期(圖1k)。

2.1.4 原腸期

草金魚受精后7.73 h，進入原腸期。囊胚層細胞繼續(xù)下包卵黃1/3進入原腸早期(圖1l)；受精后8.92 h，囊胚層細胞下包卵黃1/2，進入原腸中期(圖1m)；受精后10.57 h，囊胚下包卵黃2/3，進入原腸晚期(圖1n)。

2.1.5 神經(jīng)胚期

草金魚受精后10.80 h，囊胚細胞繼續(xù)下包卵黃至4/5，過程中細胞數(shù)量不斷增加，進入神經(jīng)胚期(圖1o)；受精后12.02 h，胚孔閉合，卵黃被完全包裹，進入胚孔閉合期(圖1p)。

2.1.6 肌節(jié)出現(xiàn)及尾泡期

草金魚受精后14.20 h，胚孔封閉后軀干中段出現(xiàn)兩段肌節(jié)，即肌節(jié)出現(xiàn)期(圖1q)；受精后14.95 h，胚體尾部出現(xiàn)圓形亮點即尾泡，即入尾泡形成期(圖1r)。

2.1.7 器官形成期

草金魚受精后15.53 h，進入器官形成期，可看到腦的前段出現(xiàn)透明囊泡即眼囊，進入眼囊期(圖1s)；受精后17.50 h，在眼囊下方可觀察到暗色斑塊狀嗅囊，進入嗅囊出現(xiàn)期(圖1t)；受精后17.78 h，出現(xiàn)錐形尾芽，進入尾芽出現(xiàn)期(圖1u)；受精后19.17 h，出現(xiàn)透明的泡狀耳囊，進入耳囊形成期(圖1v)；受精后22.50 h，可觀察到多對肌節(jié)，肌體的中段出現(xiàn)不連續(xù)性的肌肉收縮，進入肌肉效應(yīng)期(圖1w)；受精后28.67 h，心臟原基開始有節(jié)律的跳動，進入心跳期(圖1x)。

2.1.8 出膜期

受精后54.58 h，尾部清晰可見，可清晰看見頭部，進入出膜前期(圖1y)；受精后56.67 h，胚體扭動劇烈，開始破膜而出，完全破膜，進入出膜后期(圖1z)。

2.2 胚后發(fā)育

2.2.1 卵黃囊期仔魚

初孵仔魚：剛出膜的仔魚，附帶有卵黃囊，全長(4.48±0.30) mm，卵黃囊長(2.0±0.70) mm，卵黃囊膨大透明，緊貼魚體，卵黃囊約占全長的1/2，初孵仔魚靠卵黃囊中的營養(yǎng)物質(zhì)生長，初孵仔魚背部及卵黃囊上均有黑色素細胞分布，眼部清晰可見。

圖1 草金魚胚胎發(fā)育分期a. 受精卵; b. 胚盤形成; c. 2細胞期; d. 4細胞期; e . 8細胞期; f. 16細胞期; g. 32細胞期; h. 多細胞期; i. 囊胚早期; j. 囊胚中期; k. 囊胚晚期; l. 原腸早期; m. 原腸中期; n. 原腸晚期; o. 神經(jīng)胚期; p. 胚孔封閉期； q. 肌節(jié)出現(xiàn)期, →.示肌節(jié); r. 尾泡形成期， →.示尾泡; s. 眼囊出現(xiàn)期, →.示眼囊; t. 嗅囊出現(xiàn)期, →. 示嗅囊; u. 尾芽出現(xiàn)期, →. 示尾芽; v.耳囊出現(xiàn)期, →.示耳囊; w. 肌肉效應(yīng)期, →. 示肌節(jié); x. 心跳期， →.示心臟; y. 出膜前期, →.示眼部; z. 出膜期, 上方→. 示色素；下方→. 示卵黃囊.

出膜后1 d：仔魚身體伸長，卵黃囊已縮小成前端膨大，后端細長的囊。背部及卵黃囊上黑色素細胞增多，尾柄處有鰭條出現(xiàn)(圖2a)。

出膜后2 d：卵黃囊明顯變小，頭部及至全身背側(cè)皮膚出現(xiàn)黃色素細胞。仔魚卵黃囊中出現(xiàn)空泡，有吞食跡象(圖2b)。

出膜后3 d：頭部及背部色素繼續(xù)沉積，心臟色素明顯沉積，卵黃囊繼續(xù)縮小成細棒狀，平衡能力及游泳能力增強(圖2c)。

出膜后4 d：卵黃囊基本吸收完畢，后端呈針狀，縮小明顯。腸道中開始出現(xiàn)異物顆粒，眼已能不斷轉(zhuǎn)動，下頜形成并可動(圖2d)。

出膜后5 d：仔魚的卵黃囊已耗盡，進入外源性

圖2 草金魚胚胎后期發(fā)育分期a. 出膜后1 d, a1.示卵黃囊上黑色素, a2.示卵黃囊; b. 出膜后2 d, b1.示黃色素; c.出膜后3 d; d. 出膜后4 d, d1.示眼部, d2.示黃色素e. 出膜后5 d, e1.示魚鰾; f. 出膜后6 d, f1.示背部圓點狀黃色素; g. 出膜后7 d, g1.示吻部, g2.示腸道內(nèi)食物; h. 出膜后8 d; i. 出膜后9 d, i1.示峽部; j. 出膜后10 d, j1.示心臟; k. 出膜后12 d; l. 出膜后13 d; m. 出膜后15 d, m1.示鰾二室, m2.示尾鰭; n. 出膜后17 d, n1.示背鰭; o. 出膜后19 d; p. 出膜后21 d, p1.示鰓部; q. 出膜后25 d, q1.示背鰭, q2.示臀鰭; r. 出膜后34 d, r1.示鱗片; s. 出膜后36 d, s1.示鰓蓋, t. 出膜后38 d, t1.示胸鰭; u. 出膜后44 d.

營養(yǎng)階段，開始自由游動與攝食。黑色素沉積明顯，清晰可見，眼睛明顯。魚鰾中已充滿氣體，其輪廓清楚(圖2e)。

2.2.2 晚期仔魚

出膜后6 d：黑色素繼續(xù)沉積，頭部背面的黑色素細胞收縮成圓點狀而不成分枝狀(圖2f)。

出膜后7 d：消化道前端膨大，后端漸細，直通肛門，消化道中充滿食物，有排泄物排出，吻部有黑色素細胞出現(xiàn)(圖2g)。

出膜后8 d：魚體伸長，吻部黑色素細胞增多，體背黑色素細胞及黃色素細胞繼續(xù)沉積(圖2h)。

出膜后9 d：腸道為直形，有大量排泄物排出，鰓蓋膜可動，仔魚的下頜不斷運動(圖2i)。

出膜后10 d：鰓蓋膜已完全遮蓋了鰓，尾鰭基部形成了黑色素細胞和黃色素細胞的堆積(圖2j)。

出膜后12 d：頭部黑色素細胞及黃色素細胞繼續(xù)沉積，脊索末端彎向上方，尾鰭中形成了間質(zhì)的堆積(圖2k)。

出膜后13 d：頭部收縮成圓點狀的黑色素細胞增多且增大，吻部黑色素細胞繼續(xù)堆積，尾鰭的間質(zhì)開始形成了骨質(zhì)鰭條(圖2l)。

出膜后15 d：仔魚鰾的中部有從中部內(nèi)縊分為兩室的趨勢，鰾表面的黑色素細胞增多，進入鰾分二室期，可以清晰看見草金魚的尾鰭為深叉形(圖2m)。

出膜后17 d：體型增大，背鰭可見，消化道進一步增大，魚體呈半透明狀態(tài)，眼珠大而有光澤(圖2n)。

出膜后19 d：頭部及體背色素細胞進一步沉積，魚鰾二室明顯，消化道充滿體內(nèi)多部分，吞食顆粒有明顯消化現(xiàn)象(圖2o)。

出膜后21 d：背鰭明顯，臀鰭可見，尾鰭繼續(xù)增大，色素沉積明顯，魚鰓清晰可見，游動迅速，鰓部血紅色明顯(圖2p)。

出膜后25 d：背鰭與臀鰭均清晰可見，尾鰭繼續(xù)變大變厚，體背及頭部黑色素細胞收縮成圓點狀并排列緊密，吻部有圓點狀黑色素出現(xiàn)，魚體半透明部位減少(圖2q)。

2.2.3 稚魚階段

出膜后34 d：背鰭與腹鰭進一步增大，開始有鱗片出現(xiàn)，半透明部位基本消失(圖2r)。

出膜后36 d：體色進一步變化，半透明部位已大部分消失，吻部明顯，游動敏捷(圖2s)。

出膜后38 d：稚魚已基本具有成魚外形，胸鰭清晰可見，此時魚體顏色大部分呈現(xiàn)灰色，鱗片進一步增長，尾鰭大而分叉，鰓蓋張合明顯(圖2t)。

出膜后44 d：大部分魚體體色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，身體透明特征消失，稚魚階段發(fā)育完成進入幼魚期，此時平均全長達(24.08±2.56) mm，其外部形態(tài)及生活習(xí)性均與成魚相似(圖2u)。

3 討 論

3.1 生活史的劃分

近年來，對于魚類的胚胎發(fā)育研究主要集中在一些經(jīng)濟魚類及珍稀魚類中[8-9]，對于觀賞魚的胚胎及胚后發(fā)育研究較少。金魚是重要的觀賞魚種之一，養(yǎng)殖歷史可追溯到約1000年前[10]，其有著獨特的經(jīng)濟價值及研究價值，例如金魚易得且一次能夠產(chǎn)下大量卵子，其胚胎較多的應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)研究[11-13]，因此對草金魚的胚胎及胚后發(fā)育進行觀察研究有著重要的生物學(xué)意義。目前通常將魚類的早期生活史階段劃分為卵(胚胎)、仔魚及稚魚3個基本發(fā)育期[14]。在魚類早期生活史劃分的研究中，存在許多不同的觀點及不同的標準[15-17]，本研究采用“孵化”作為卵和仔魚期的劃分界限。

3.2 草金魚胚胎發(fā)育特點

與其他鯉科魚類一樣，草金魚受精卵的整個胚胎發(fā)育過程分為7個發(fā)育階段，包括卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期和器官形成期等，共歷時56.67 h。20世紀中期，李璞等[18]對金魚及鯽魚的胚胎發(fā)育分期進行了研究，發(fā)現(xiàn)它們之間基本上是相似的，可以代表典型的硬骨魚類發(fā)育過程。Tsai等[19]研究發(fā)現(xiàn)，普通金魚和斑馬魚(Daniorerio)這兩種硬骨魚類胚胎發(fā)育過程中整體形態(tài)特征十分相似，可將成熟的斑馬魚分子生物學(xué)技術(shù)用于金魚胚胎研究，可以進一步研究馴化與發(fā)育的進化關(guān)系。由于繁殖條件及種屬的不同，不同魚類胚胎發(fā)育所耗時間也不盡相同，其中在相同溫度下(23.0±1.0) ℃草金魚孵化時間略小于銀鯽(C.auratusgibelio)與普通鯽魚[20]，滇池高背鯽(C.auratus)受精卵在水溫 12.9～15.0 ℃下，歷時174.88 h孵化[21]，在斑鱖(Sinipercascherzeri)[22]、中華倒刺鲃(Spinibarbussinensis)[23]等魚類中，溫度也會影響胚胎發(fā)育進程。

3.3 草金魚胚后發(fā)育特點

草金魚受精卵經(jīng)56.67 h后孵化，初孵仔魚培育溫度為19～22 ℃，出膜后4 d卵黃囊基本消失，5 d卵黃囊耗盡。鯉科魚類馬口魚 (Opsariichthysbidens)在26～28 ℃水溫下，經(jīng)108 h孵化后，卵黃囊消耗殆盡[24]；鯉科魚類唐魚(Tanichthysalbonubes)[25]在水溫23～29 ℃時，初孵仔魚5 d卵黃耗盡；鯉科魚類中華倒刺鲃[26]在水溫21.5～28 ℃條件下，6 d卵黃囊耗盡。卵黃囊期持續(xù)時間的長短受多因素影響，最主要的影響因素為溫度，溫度越高，卵黃囊消失越快，另外，營養(yǎng)(攝食)也是影響魚類生長的一個重要因素[27]。史先武等[28]研究發(fā)現(xiàn)，水溫保持在19～22 ℃時，長尾紅草金魚卵黃囊4 d基本消失；張國真等[29]研究發(fā)現(xiàn)，水溫約20 ℃時，草金魚卵黃囊3 d基本消失，本研究結(jié)果與前者的研究結(jié)果相同，而與后者研究的卵黃囊消失時間不同，這可能是由于本研究與前者的研究條件類似。草金魚孵化5 d后卵黃囊完全消失，進入外源性營養(yǎng)階段，開始攝食，這與唐魚[25]、齊口裂腹魚(Scizothoraxprenanti)[30]開始覓食的時間相同。許多魚類的仔魚在由內(nèi)源性營養(yǎng)轉(zhuǎn)化到外源性營養(yǎng)的過渡階段常會出現(xiàn)大量死亡,其原因受多因素影響，但能否及時補充外源性營養(yǎng)是一重要影響因素[31]。

4 結(jié) 論

通過研究發(fā)現(xiàn)草金魚受精卵為黃綠色，呈卵圓形，在水溫(23.0±1.0) ℃下，歷時56.67 h完成整個胚胎發(fā)育過程。胚后發(fā)育可分為仔魚期、稚魚期和幼魚期。其中仔魚期又可分為卵黃囊仔魚期和后期仔魚，在水溫19～22 ℃的條件下，出膜后5 d，卵黃囊吸收完畢，卵黃囊仔魚期結(jié)束，進入后期仔魚階段。培育至34日齡，開始出現(xiàn)鱗片，標志后期仔魚發(fā)育完成，進入稚魚期，在44日齡時，鱗片生長完全，身體透明特征消失，稚魚階段發(fā)育完成，進入幼魚期。在胚胎及胚后發(fā)育過程中，溫度對其發(fā)育速度影響很大，因此在進行研究和繁殖實踐中要嚴格控制孵化和培育溫度。