米諾環(huán)素又稱二甲胺四環(huán)素、美滿霉素、美諾星、康尼Minocycline、Minomycin、Klinomycin等，是一種高效、速效、長(zhǎng)效的新半合成四環(huán)素類抗生素，其抗菌作用為該屬中最強(qiáng)，抗菌譜與多西環(huán)素相似，作用較四環(huán)素強(qiáng)2～4倍，也勝過(guò)多西環(huán)素、美他環(huán)素、土霉素。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)米諾環(huán)素的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法(HPLC)薄層色譜法(TLC)以及毛細(xì)管電泳法(CE)，這些方法雖然檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高,但是待測(cè)樣品前處理過(guò)程復(fù)雜、費(fèi)時(shí)。免疫學(xué)方法基于抗原、抗體之間的特異反應(yīng),具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，是殘留檢測(cè)的有效方法,不僅適用于大量樣品的快速篩選,某些情況下也可以用于確證性檢測(cè)。

米諾環(huán)素為小分子化合物，本身不具有免疫原性，運(yùn)用免疫學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)首先應(yīng)將其與大分子蛋白質(zhì)載體進(jìn)行偶聯(lián)，產(chǎn)生所需的免疫原性。本文應(yīng)用戊二醛法和重氮化法將米諾環(huán)素在適當(dāng)?shù)臈l件下與牛血清白蛋白(BSA)進(jìn)行偶聯(lián),合成了MNC完全抗原MNC-BSA，免疫動(dòng)物后制成多克隆抗體，旨在為米諾環(huán)素殘留免疫學(xué)快速檢測(cè)方法的建立奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

材料

米諾環(huán)素由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；新西蘭大白兔由沈陽(yáng)市盛京醫(yī)院提供。

試劑與儀器

弗氏完全佐劑(CFA)、弗氏不完全佐劑(IFA) sigma公司；牛血清白蛋白(BSA) 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；戊二醛(GA)、考馬斯亮蘭G250、甲醇鈉-甲醇溶液均為分析純。

Model 68酶標(biāo)儀 Bio—Rad公司；TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RET BASIC磁力攪拌器 德國(guó)IKA公司；LZG-02冷凍干燥機(jī) 康源保鮮技術(shù)發(fā)展公司；DNP—9162型恒溫箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司 。

米諾環(huán)素人工抗原的合成

戊二醛法合成法：稱取7.5mg MNC和34mg BSA分別溶于1ml超純水和10ml PBS（0.1mol/L pH=7.4的磷酸緩沖液），將MNC溶液在攪拌下加入BSA溶液，緩慢滴入0.2ml 25% 戊二醛，攪拌4h,5000r/min離心10min，上清液于磷酸緩沖液（0.01 mol/L pH=7.4）中4℃下透析5d，每天換兩次透析液，透析完畢后冷凍干燥，分裝，-20℃凍存，備用。

重氮化法合成法：稱取7.5mg溶解在5ml超純水中，加入8ml溴水堿液，4℃下預(yù)冷。避光向上述反應(yīng)液中緩慢滴加1mol/L的鹽酸調(diào)pH值至2.5，4℃避光逐滴滴加1ml預(yù)冷的亞硝酸鈉貯備液到上述反應(yīng)液，冰箱孵育1h，將重氮化的MNC按20：1比例慢慢加入BSA溶液，冰箱孵育24h，隨后于4℃下透析5d，每天換兩次透析液，透析完畢后冷凍干燥，分裝，-20℃凍存，備用。

人工抗原的鑒定與結(jié)合比的測(cè)定

用磷酸緩沖液PBS配制適宜濃度的BSA與MNC標(biāo)準(zhǔn)液，適當(dāng)稀釋后以PBS為空白，在波長(zhǎng)200-500nm下對(duì)他們進(jìn)行紫外掃描，繪制紫外吸收光譜曲線。按合成米諾環(huán)素完全抗原和包被抗原反應(yīng)所用半抗原、載體蛋白與偶聯(lián)產(chǎn)物的比例，用紫外分光光度計(jì)掃描測(cè)定，按(1)式計(jì)算偶聯(lián)物的結(jié)合比。

式中：Ca／Cb—偶聯(lián)物中A、B兩種物質(zhì)摩爾濃度比(結(jié)合比)；ACam、ACbm—偶聯(lián)物分別在A、B最大吸收波長(zhǎng)下的吸光值；KAam、KBbm—A、B在各自最大吸收波長(zhǎng)下的摩爾消光系數(shù)；KAbm—A在B最大吸收峰波長(zhǎng)處的摩爾消光系數(shù)；KBam—B在A最大吸收峰波長(zhǎng)處的摩爾消光系數(shù)。

抗體的制備與純化

選用2只體重2kg左右的雄性新西蘭大白兔分別為1、2號(hào)兔進(jìn)行免疫,共5次,免疫前采血作為陰性血清。首次免疫：將2mg/ml完全抗原與等量弗氏完全佐劑(CFA)充分乳化后進(jìn)行皮下10點(diǎn)注射。加強(qiáng)免疫：每隔14d加強(qiáng)免疫一次,劑量不變,CFA換成弗氏不完全佐劑(IFA)。每次加強(qiáng)免疫一周后，耳緣靜脈采血，檢測(cè)效價(jià)。當(dāng)效價(jià)達(dá)到一定水平，停止免疫7d后心臟穿刺采血，分離抗血清，并采用辛酸一硫酸銨二步沉淀法純化抗體，制成凍干粉，于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

抗體免疫活性的測(cè)定

抗體效價(jià)的測(cè)定

抗血清效價(jià)測(cè)定參照文獻(xiàn)，利用間接ELISA法測(cè)定免疫獲得的抗體效價(jià)。

工作濃度

采用方陣實(shí)驗(yàn)法測(cè)定包被抗原和酶標(biāo)抗體稀釋度，確定直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法抗原和酶標(biāo)抗體最適工作濃度。OD490值約為1.0，抗體-抗原用的濃度組合即為抗體-抗原的工作濃度。

抗體的特異性考察

參照上述間接ELISA法和方陣滴定法確定抗原抗體的最適工作濃度，在最佳工作條件下，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)MNC抗血清與氯霉素、鏈霉素、紅霉素、金霉素、土霉素、多西環(huán)素等其它抗菌素的交叉反應(yīng)率。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法操作步驟與間接ELISA基本一致，不同的是封閉反應(yīng)完成后加入的不是倍比稀釋的待測(cè)血清，而是將梯度稀釋的藥品溶液與固定濃度的抗血清混合，分別加入板孔中．以空白對(duì)照0 ng／mL MNC時(shí)的吸光值為B0，不同質(zhì)量濃度MNC競(jìng)爭(zhēng)后的吸光值為B，以B／B0為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(ng／mL)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)MNC的抑制曲線，同時(shí)根據(jù)下列公式計(jì)算交叉反應(yīng)率。

結(jié)果與分析

人工抗原的鑒定

半抗原MNC分別在波長(zhǎng)222、252、273和348nm處有典型吸收峰。由圖1可以看出,戊二醛合成法合成的MNC-BSA的最大吸收峰由原來(lái)在278nm處呈最大吸收峰的BSA逐漸向252nm處偏移，直至波長(zhǎng)266nm處。BSA的最大吸收波長(zhǎng)為278nm，在300-400nm幾乎無(wú)吸收，而結(jié)合物的紫外光譜在300nm長(zhǎng)波方向有明顯的吸收值，并且相同濃度的結(jié)合物和標(biāo)準(zhǔn)蛋白的紫外光譜相比較，吸光度明顯增加，光譜明顯具有MNC和蛋白疊加的特性。重氮化法合成的完全抗原也有相同的特性。以上結(jié)論表明兩種偶聯(lián)方法中米諾環(huán)素（MNC）和牛血清白蛋白（BSA）載體已經(jīng)發(fā)生偶聯(lián)。

圖1 戊二醛法和重氮化法合成的兩種完全抗原的紫外掃描光譜圖

人工抗原結(jié)合比的測(cè)定：

經(jīng)計(jì)算戊二醛法與重氮化法半抗原與BSA的結(jié)合比分別人為9.9和5.9。兩種方法的偶聯(lián)比差異明顯，其中，戊二醛法的效果明顯好于重氮化法。所以采用戊二醛合成法合成的復(fù)合物為抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)。

多克隆抗體效價(jià)及工作濃度

用間接ELISA測(cè)定經(jīng)免疫獲得的抗血清的效價(jià)為16000。經(jīng)方陣實(shí)驗(yàn)法測(cè)定包被抗原和抗體的稀釋度，確定直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法中抗原和抗體的最適工作濃度分別為抗原2ug/ml、酶標(biāo)抗體4ug/ml。

表1 米諾環(huán)素與其他抗生素的交叉反應(yīng)率

多克隆抗體的特異性考察

多克隆抗體的特異性鑒定：

在最佳的包被抗原與抗體濃度下，加抗體的同時(shí)加入米諾環(huán)素或其他結(jié)構(gòu)類似化合物（土霉素、金霉素、多西環(huán)素、青霉素等），檢測(cè)米諾環(huán)素及類似物對(duì)獲得的米諾環(huán)素多克隆抗體的交叉反應(yīng)情況。由表1可知，實(shí)驗(yàn)獲得的抗體除與土霉素和多西環(huán)素和金霉素有交叉反應(yīng)外，與其他化合物未見(jiàn)交叉，交叉反應(yīng)率均小于0.1%。

米諾環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在優(yōu)化的條件下對(duì)不同濃度的米諾環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行測(cè)定，以米諾環(huán)素質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖，即得其標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖2）

從標(biāo)準(zhǔn)曲線可以判定，在7.8～500ng/ml的濃度范圍內(nèi)，米諾環(huán)素質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)和抑制率成線性相關(guān)。其線性方程為Y=28.839x-12.97 R2=0.9874

圖2 米諾環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)回歸方程計(jì)算，IC50=152.6ng/ml 其最低檢出限IC10=6.3ng/ml

結(jié)果與討論

目前,我國(guó)進(jìn)出口食品中四環(huán)素類的殘留檢測(cè)采用的是高效液相色譜法,這種方法對(duì)被測(cè)樣品的前處理要求高,檢測(cè)的靈敏度不夠高,而免疫學(xué)檢測(cè)方法具有快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。在免疫學(xué)檢測(cè)中，抗原和抗體的制備是整個(gè)分析方法中最為關(guān)鍵的技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)分別采用戊二醛法和重氮化法，將載體蛋白與半抗原MNC進(jìn)行偶聯(lián)，得到了完全抗原MNC-BSA，采用戊二醛法合成的抗原偶聯(lián)比達(dá)到10，而且用本法合成的完全抗原免疫兔，抗血清效價(jià)達(dá)到1:16000。

交叉實(shí)驗(yàn)表明，米諾環(huán)素除對(duì)四環(huán)素類抗生素交叉反應(yīng)較高外，對(duì)其他類似藥物均表現(xiàn)出較低的交叉反應(yīng)性（＜0.1），因此可應(yīng)用于四環(huán)素類多殘留檢測(cè)。本文測(cè)定的最低檢測(cè)限為6.3ng·ml-1，遠(yuǎn)低于動(dòng)物性食品中米諾環(huán)素殘留標(biāo)準(zhǔn)，可滿足米諾環(huán)素殘留快速檢測(cè)的需要，并為后期單克隆抗體的制備和膠體金免疫層析法檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。