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        米諾環(huán)素多克隆抗體的制備

        2018-12-06 06:09:20郭德超,鄭鳳娥,杜翠榮
        食品安全導刊 2018年32期
        關(guān)鍵詞:戊二醛米諾偶聯(lián)

        米諾環(huán)素又稱二甲胺四環(huán)素、美滿霉素、美諾星、康尼Minocycline、Minomycin、Klinomycin等,是一種高效、速效、長效的新半合成四環(huán)素類抗生素,其抗菌作用為該屬中最強,抗菌譜與多西環(huán)素相似,作用較四環(huán)素強2~4倍,也勝過多西環(huán)素、美他環(huán)素、土霉素。目前國內(nèi)外有關(guān)米諾環(huán)素的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)薄層色譜法(TLC)以及毛細管電泳法(CE),這些方法雖然檢測結(jié)果準確、靈敏度高,但是待測樣品前處理過程復雜、費時。免疫學方法基于抗原、抗體之間的特異反應,具有快速、靈敏、特異性強、操作簡單等特點,是殘留檢測的有效方法,不僅適用于大量樣品的快速篩選,某些情況下也可以用于確證性檢測。

        米諾環(huán)素為小分子化合物,本身不具有免疫原性,運用免疫學方法進行檢測首先應將其與大分子蛋白質(zhì)載體進行偶聯(lián),產(chǎn)生所需的免疫原性。本文應用戊二醛法和重氮化法將米諾環(huán)素在適當?shù)臈l件下與牛血清白蛋白(BSA)進行偶聯(lián),合成了MNC完全抗原MNC-BSA,免疫動物后制成多克隆抗體,旨在為米諾環(huán)素殘留免疫學快速檢測方法的建立奠定基礎。

        材料與方法

        材料

        米諾環(huán)素由中國藥品生物制品檢定所提供;新西蘭大白兔由沈陽市盛京醫(yī)院提供。

        試劑與儀器

        弗氏完全佐劑(CFA)、弗氏不完全佐劑(IFA) sigma公司;牛血清白蛋白(BSA) 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;戊二醛(GA)、考馬斯亮蘭G250、甲醇鈉-甲醇溶液均為分析純。

        Model 68酶標儀 Bio—Rad公司;TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;RET BASIC磁力攪拌器 德國IKA公司;LZG-02冷凍干燥機 康源保鮮技術(shù)發(fā)展公司;DNP—9162型恒溫箱 上海精宏實驗設備有限公司 。

        米諾環(huán)素人工抗原的合成

        戊二醛法合成法:稱取7.5mg MNC和34mg BSA分別溶于1ml超純水和10ml PBS(0.1mol/L pH=7.4的磷酸緩沖液),將MNC溶液在攪拌下加入BSA溶液,緩慢滴入0.2ml 25% 戊二醛,攪拌4h,5000r/min離心10min,上清液于磷酸緩沖液(0.01 mol/L pH=7.4)中4℃下透析5d,每天換兩次透析液,透析完畢后冷凍干燥,分裝,-20℃凍存,備用。

        重氮化法合成法:稱取7.5mg溶解在5ml超純水中,加入8ml溴水堿液,4℃下預冷。避光向上述反應液中緩慢滴加1mol/L的鹽酸調(diào)pH值至2.5,4℃避光逐滴滴加1ml預冷的亞硝酸鈉貯備液到上述反應液,冰箱孵育1h,將重氮化的MNC按20:1比例慢慢加入BSA溶液,冰箱孵育24h,隨后于4℃下透析5d,每天換兩次透析液,透析完畢后冷凍干燥,分裝,-20℃凍存,備用。

        人工抗原的鑒定與結(jié)合比的測定

        用磷酸緩沖液PBS配制適宜濃度的BSA與MNC標準液,適當稀釋后以PBS為空白,在波長200-500nm下對他們進行紫外掃描,繪制紫外吸收光譜曲線。按合成米諾環(huán)素完全抗原和包被抗原反應所用半抗原、載體蛋白與偶聯(lián)產(chǎn)物的比例,用紫外分光光度計掃描測定,按(1)式計算偶聯(lián)物的結(jié)合比。

        式中:Ca/Cb—偶聯(lián)物中A、B兩種物質(zhì)摩爾濃度比(結(jié)合比);ACam、ACbm—偶聯(lián)物分別在A、B最大吸收波長下的吸光值;KAam、KBbm—A、B在各自最大吸收波長下的摩爾消光系數(shù);KAbm—A在B最大吸收峰波長處的摩爾消光系數(shù);KBam—B在A最大吸收峰波長處的摩爾消光系數(shù)。

        抗體的制備與純化

        選用2只體重2kg左右的雄性新西蘭大白兔分別為1、2號兔進行免疫,共5次,免疫前采血作為陰性血清。首次免疫:將2mg/ml完全抗原與等量弗氏完全佐劑(CFA)充分乳化后進行皮下10點注射。加強免疫:每隔14d加強免疫一次,劑量不變,CFA換成弗氏不完全佐劑(IFA)。每次加強免疫一周后,耳緣靜脈采血,檢測效價。當效價達到一定水平,停止免疫7d后心臟穿刺采血,分離抗血清,并采用辛酸一硫酸銨二步沉淀法純化抗體,制成凍干粉,于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

        抗體免疫活性的測定

        抗體效價的測定

        抗血清效價測定參照文獻,利用間接ELISA法測定免疫獲得的抗體效價。

        工作濃度

        采用方陣實驗法測定包被抗原和酶標抗體稀釋度,確定直接競爭ELISA法抗原和酶標抗體最適工作濃度。OD490值約為1.0,抗體-抗原用的濃度組合即為抗體-抗原的工作濃度。

        抗體的特異性考察

        參照上述間接ELISA法和方陣滴定法確定抗原抗體的最適工作濃度,在最佳工作條件下,用間接競爭ELISA法檢測MNC抗血清與氯霉素、鏈霉素、紅霉素、金霉素、土霉素、多西環(huán)素等其它抗菌素的交叉反應率。間接競爭ELISA法操作步驟與間接ELISA基本一致,不同的是封閉反應完成后加入的不是倍比稀釋的待測血清,而是將梯度稀釋的藥品溶液與固定濃度的抗血清混合,分別加入板孔中.以空白對照0 ng/mL MNC時的吸光值為B0,不同質(zhì)量濃度MNC競爭后的吸光值為B,以B/B0為縱坐標,質(zhì)量濃度(ng/mL)的對數(shù)為橫坐標,繪制標準MNC的抑制曲線,同時根據(jù)下列公式計算交叉反應率。

        結(jié)果與分析

        人工抗原的鑒定

        半抗原MNC分別在波長222、252、273和348nm處有典型吸收峰。由圖1可以看出,戊二醛合成法合成的MNC-BSA的最大吸收峰由原來在278nm處呈最大吸收峰的BSA逐漸向252nm處偏移,直至波長266nm處。BSA的最大吸收波長為278nm,在300-400nm幾乎無吸收,而結(jié)合物的紫外光譜在300nm長波方向有明顯的吸收值,并且相同濃度的結(jié)合物和標準蛋白的紫外光譜相比較,吸光度明顯增加,光譜明顯具有MNC和蛋白疊加的特性。重氮化法合成的完全抗原也有相同的特性。以上結(jié)論表明兩種偶聯(lián)方法中米諾環(huán)素(MNC)和牛血清白蛋白(BSA)載體已經(jīng)發(fā)生偶聯(lián)。

        圖1 戊二醛法和重氮化法合成的兩種完全抗原的紫外掃描光譜圖

        人工抗原結(jié)合比的測定:

        經(jīng)計算戊二醛法與重氮化法半抗原與BSA的結(jié)合比分別人為9.9和5.9。兩種方法的偶聯(lián)比差異明顯,其中,戊二醛法的效果明顯好于重氮化法。所以采用戊二醛合成法合成的復合物為抗原進行動物免疫實驗。

        多克隆抗體效價及工作濃度

        用間接ELISA測定經(jīng)免疫獲得的抗血清的效價為16000。經(jīng)方陣實驗法測定包被抗原和抗體的稀釋度,確定直接競爭ELISA法中抗原和抗體的最適工作濃度分別為抗原2ug/ml、酶標抗體4ug/ml。

        表1 米諾環(huán)素與其他抗生素的交叉反應率

        多克隆抗體的特異性考察

        多克隆抗體的特異性鑒定:

        在最佳的包被抗原與抗體濃度下,加抗體的同時加入米諾環(huán)素或其他結(jié)構(gòu)類似化合物(土霉素、金霉素、多西環(huán)素、青霉素等),檢測米諾環(huán)素及類似物對獲得的米諾環(huán)素多克隆抗體的交叉反應情況。由表1可知,實驗獲得的抗體除與土霉素和多西環(huán)素和金霉素有交叉反應外,與其他化合物未見交叉,交叉反應率均小于0.1%。

        米諾環(huán)素標準曲線的繪制

        在優(yōu)化的條件下對不同濃度的米諾環(huán)素標準液進行測定,以米諾環(huán)素質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標,抑制率為縱坐標作圖,即得其標準曲線(如圖2)

        從標準曲線可以判定,在7.8~500ng/ml的濃度范圍內(nèi),米諾環(huán)素質(zhì)量濃度的對數(shù)和抑制率成線性相關(guān)。其線性方程為Y=28.839x-12.97 R2=0.9874

        圖2 米諾環(huán)素標準曲線

        根據(jù)回歸方程計算,IC50=152.6ng/ml 其最低檢出限IC10=6.3ng/ml

        結(jié)果與討論

        目前,我國進出口食品中四環(huán)素類的殘留檢測采用的是高效液相色譜法,這種方法對被測樣品的前處理要求高,檢測的靈敏度不夠高,而免疫學檢測方法具有快速、靈敏等優(yōu)點。在免疫學檢測中,抗原和抗體的制備是整個分析方法中最為關(guān)鍵的技術(shù)。本實驗分別采用戊二醛法和重氮化法,將載體蛋白與半抗原MNC進行偶聯(lián),得到了完全抗原MNC-BSA,采用戊二醛法合成的抗原偶聯(lián)比達到10,而且用本法合成的完全抗原免疫兔,抗血清效價達到1:16000。

        交叉實驗表明,米諾環(huán)素除對四環(huán)素類抗生素交叉反應較高外,對其他類似藥物均表現(xiàn)出較低的交叉反應性(<0.1),因此可應用于四環(huán)素類多殘留檢測。本文測定的最低檢測限為6.3ng·ml-1,遠低于動物性食品中米諾環(huán)素殘留標準,可滿足米諾環(huán)素殘留快速檢測的需要,并為后期單克隆抗體的制備和膠體金免疫層析法檢測奠定了基礎。

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