張 森，歐 婧，熊紹斌，楊昌海，趙嬋娟

(1.黔東南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州凱里 556000； 2.貴州省雷山縣丹江鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，貴州雷山 557100；3.重慶三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，重慶萬州 404155)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)，是一種廣泛存在于環(huán)境中的革蘭陽性菌，可引起局部膿腫、關(guān)節(jié)炎、乳房炎、外傷化膿感染、骨膜炎、心包炎、肺炎及敗血癥等多種疾病[1]。據(jù)研究，分離于患乳房炎奶牛的耐藥性SA與分離于人的耐藥性SA的基因型十分相似[2]，因此SA是一種人畜共患傳染病病原菌。由于環(huán)境中的廣泛存在，金黃色葡萄球極易污染食物，產(chǎn)生中毒性休克毒素1、凝集因子A及腸毒素等多種外毒素，引起嚴(yán)重的食物中毒[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在美國由SA腸毒素引起的食物中毒占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的33%，SA已廣泛引起獸醫(yī)和公共衛(wèi)生安全的密切關(guān)注[4]。由于畜牧生產(chǎn)中抗生素的大量使用或不規(guī)范使用，導(dǎo)致90%以上的SA可產(chǎn)生β內(nèi)酰胺酶，使青霉素水解失活，表現(xiàn)耐藥性，特別是耐甲氧西林SA，它不僅對(duì)甲氧西林耐藥，而且對(duì)其他多種抗生素亦耐藥[5]，極大增加了畜牧生產(chǎn)中該病的防控難度。許多研究表明，某些中草藥能有效抑制病原微生物，尤其是對(duì)耐藥性病原微生物也有相應(yīng)的抑制效果，對(duì)畜禽傳染病有很好的預(yù)防和治療作用。在黔東南苗寨中流傳著一些在治療跌打損傷、毒蟲叮咬等外傷疾病方面有一定療效的民間草藥。本試驗(yàn)通過觀察4種民間草藥對(duì)SA的體外抑菌效果，為民間草藥在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用開發(fā)提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥物與菌株 翻白草(PotentilladiscolorBge，2017年5月份采集)、白接骨(Asystasiellaneesiana(Wall.) Lindau，2016年8月份采集)、樹莓(RubuscorchorifoliusL.f，2016年12月份采集)、木藍(lán)(IndigoferatinctoriaLinn，2017年5月份采集)均在本地采集，由黔東南民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院植物組織培養(yǎng)中心鑒定為正品；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923菌株，由貴州大學(xué)生化中心保存提供。

1.1.2 主要儀器與試劑 SW-CJ-2D凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；LS-30高壓滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)；KJ14麥?zhǔn)媳葷峁?，北京哲成科技有限公司產(chǎn)品；JA003電子秤，上海舜宇橫平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DHP-500電熱恒溫培養(yǎng)箱，金壇大地自動(dòng)化儀器廠生產(chǎn)；DHG-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)：20170508001)，杭州百思生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 藥液制備 將采集的藥物置恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，在45℃條件下烘干。將烘干的藥物粉碎成粗粉，分別稱取各草藥10 g，放入三角燒瓶中，加100 mL 800 mL/L乙醇，置于超聲波機(jī)中超聲助溶1 h，減壓抽濾提取液。按此方法提取3次，合并3次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，給濃縮液中加吐溫-80 0.5 mL助溶，再用蒸餾水定容至50 mL，最終藥液生藥濃度為200 mg/mL，過濾除菌，備用。

1.2.2 菌液的制備 按無菌操作法，將保存的菌種劃線接種于10 g/L瓊脂營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，37℃條件下培養(yǎng)18 h，挑取單個(gè)菌落接種于5 mL無菌營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)12 h，用滅菌的肉湯培養(yǎng)基稀釋至0.5麥?zhǔn)蠞岫?，即約1.5×108cfu/mL。取適量菌液用滅菌肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行100倍稀釋，菌懸液濃度為1.5×106cfu/mL，備用。

1.2.3 體外抑菌作用測定 采用管碟法[6]，按無菌操作要求，分別吸取150 μL各配制備用的細(xì)菌液至10 g/L的瓊脂肉湯培養(yǎng)板上，用“L”棒涂布均勻，在超凈工作臺(tái)上室溫條件下放置5 min，等距離放置滅菌牛津杯(規(guī)格10 mm×8 mm×6 mm)，靜置10 min使其和培養(yǎng)板表面嚴(yán)實(shí)無縫。給每個(gè)牛津杯中加入相應(yīng)的藥物100 μL，4℃放置8 h，使藥物擴(kuò)散，然后將培養(yǎng)皿置37℃培養(yǎng)18 h，觀察，并用游標(biāo)卡尺十字法測量抑菌圈直徑，取平均值。每種藥物和菌株平行做3次重復(fù)。結(jié)果判定：抑菌圈<10 mm為不敏感，10 mm～19 mm為中度敏感，≥20 mm為高度敏感[7]。

1.2.4 MIC和MBC的測定 采用微量法[8]。按操作方法，取一次性無菌96孔培養(yǎng)板，每行12孔，每孔加100 μL肉湯培養(yǎng)基，吸取100 μL藥物加入第1孔，混勻后，吸取100 μL到第2孔，以此類推至第10孔，混勻后，棄100 μL，每孔接種10 μL菌液；第11孔加入10 μL無菌蒸餾水，為陰性對(duì)照，第12孔接種10 μL菌液，為細(xì)菌生長對(duì)照。將96孔培養(yǎng)板加蓋置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，觀察細(xì)菌生長情況。結(jié)果判定：與陰性對(duì)照對(duì)比，如渾濁或有沉淀，則判斷為有菌生長；如透明度與陰性對(duì)照相同，則判斷無菌生長。以無菌生長所對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度為該藥物對(duì)此菌的MIC。然后，將每孔培養(yǎng)液劃線接種10 g/L瓊脂營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)18 h，觀測細(xì)菌生長情況，無菌落生成對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度為該藥物對(duì)此菌的MBC。每種菌株做3個(gè)平行重復(fù)試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 體外抑菌結(jié)果

4味草藥醇提物均出現(xiàn)了較為明顯的抑菌圈，經(jīng)測量統(tǒng)計(jì)分析，白接骨、翻白草、木藍(lán)及樹莓這4種草藥醇提物對(duì)SA的抑菌圈直徑分別為41.28 mm±1.23 mm、26.13 mm±1.03 mm、 22.14 mm±1.08 mm和23.83 mm±1.32 mm。通過數(shù)據(jù)顯示，這4味草藥醇提物對(duì)SA的抑菌圈直徑均超過了20 mm，其中白接骨醇提物的抑菌圈達(dá)到了40 mm以上，表明這4味草藥在體外對(duì)金黃色葡萄菌均表現(xiàn)較強(qiáng)的抑制作用，其中白接骨抑菌效果最優(yōu)(圖1)。

A1，A2，A3為白接骨3個(gè)重復(fù)；B1，B2，B3為翻白草3個(gè)重復(fù)；C1，C2，C3為木藍(lán)3個(gè)重復(fù)；D1，D2，D3為樹莓3個(gè)重復(fù)

A1，A2 and A3 were 3 repeats ofAsystasiellaneesiana; B1，B2 and B3 were 3 repeats ofPotentilladiscolor；C1，C2 and C3 were 3 repeats ofIndigoferatinctoria；D1，D2 and D3 were 3 repeats ofRubuscorchorifolius

圖1 4味草藥醇提物對(duì)SA抑菌作用

Fig.1 The inbibitory effects of 4 kind of herbal medicine alcohol
extracts on SAinvitro

2.2 MIC測定結(jié)果

采用微量稀釋法定量測定4味草藥醇提物對(duì)SA的MIC(表1)，白接骨、翻白草、木藍(lán)和樹莓分別在第8個(gè)稀釋度(0.78 mg/mL)、第6個(gè)稀釋度(3.13 mg/mL)、第5個(gè)稀釋度(6.25 mg/mL)和第7個(gè)稀釋度(1.56 mg/mL)。以上結(jié)果顯示，這4味草藥在較低的濃度就有抑制SA的作用，其作用效果為白接骨>樹莓>翻白草>木藍(lán)。

2.3 MBC測定結(jié)果

通過對(duì)不同濃度藥物作用的菌液進(jìn)行劃線培養(yǎng)(圖2和表2)，白接骨、翻白草、木藍(lán)和樹莓分別在第7個(gè)稀釋度(1.56 mg/mL)、第6個(gè)稀釋度(3.12 mg/mL)、第4個(gè)稀釋度(12.50 mg/mL)和第6個(gè)稀釋度(3.12 mg/mL)。

表1 4味草藥醇提物對(duì)SA MIC測定結(jié)果

注： “N”為陰性對(duì)照，“P”為細(xì)菌生長對(duì)照；“-”為培養(yǎng)液澄清，“+”為培養(yǎng)液輕微渾濁，“++”為培養(yǎng)液明顯輕微渾濁。

Note:“N” negative control; “P” positive control; “-” medium clarification；“+” medium turbidity slightly；“++” medium turbidity distinctly.

A.白接骨；B.翻白草；C.木藍(lán)；D.樹莓

A.Asystasiellaneesiana; B.Potentilladiscolor；C.Indigoferatinctoria；D.Rubuscorchorifolius

圖2 4味草藥醇提物體外對(duì)SA MBC結(jié)果

注： “N”為陰性對(duì)照，“P”為細(xì)菌生長對(duì)照；“-”為無菌落生長，“+”為有少量菌落生長，“++”為有大量菌落生長。

Note:“N” negative control; “P” positive control; “-” no colony growth; “+” a small amount of colonies；“++” a large number of colonies.

3 討論

隨著我國養(yǎng)殖的集約化程度越來越高，SA感染的發(fā)病率亦越來越高，目前應(yīng)用抗菌藥是防治該菌感染的主要途徑，然而由于SA極易產(chǎn)生耐藥性，王豪舉等[9]從重慶市部分養(yǎng)殖場采集466份糞便樣品，其中分離出25株SA，包括17株雞源菌株和8株豬源菌株，經(jīng)藥敏分析，25菌株多為多重耐藥，其中23株對(duì)氨芐西林、青霉素G、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、林可霉素耐藥嚴(yán)重，耐藥率超過60%。張倩等[10]從新疆石河子地區(qū)規(guī)?；膛霾杉?5份奶樣中共分離出127株細(xì)菌，其中60株為SA，占47.24%，經(jīng)藥敏試驗(yàn)，所有菌株對(duì)桿菌肽、青霉素、頭孢氨芐、強(qiáng)力霉素、氟苯尼考等常用抗生素高度耐藥。隨著耐藥性的不斷產(chǎn)生，抗菌藥的使用量也不斷加大，極大的增加了化學(xué)藥物殘留和一些藥源性疾病對(duì)食品安全的威脅[11]。許多研究表明，某些中草藥能有效抑制病原微生物，對(duì)畜禽傳染病有很好的預(yù)防和治療作用。研究發(fā)現(xiàn)，多種中藥及其單體對(duì)MRSA具有良好的抑菌效果[12-13]，如黃連、大黃、牡丹皮、丁香、連翹和鴉膽子等均對(duì)多重耐藥性SA有較好的體外抑制作用[14-15]。黔東南民間常用翻白草、白接骨、樹莓和木藍(lán)4種草藥治療人外傷出血、跌打損傷等外科性疾病，有一定的效果，然而這4種草藥目前沒有深入的現(xiàn)代藥理學(xué)研究報(bào)道。SA是外傷感染的主要病原菌之一，本試驗(yàn)觀察了這4味草藥在體外對(duì)SA的抗菌活性，為該幾種民間草藥的應(yīng)用開發(fā)提供試驗(yàn)參考。結(jié)果顯示，這4味藥物醇提物(200 mg/mL生藥濃度)的抑菌圈直徑均達(dá)到了20 mm以上，呈高度敏感。通過抑菌圈直徑分析，這4味藥物的抑菌效果為白接骨>翻白草>樹莓>木藍(lán)。MIC和MBC測定結(jié)果基本與抑菌圈直徑結(jié)果一致。提示這4種民間草藥具很強(qiáng)的抑制SA的作用，其中白接骨的抑菌效果尤為突出，其抑菌圈直徑達(dá)41.28±1.23 mm，MIC和MBC分別達(dá)到0.78 mg/mL和1.56 mg/mL。筆者通過預(yù)試驗(yàn)觀察到白接骨水提劑對(duì)SA的體外抑制作用明顯弱于醇提物，提示白接骨的主要抗菌成分可能是醇溶性的，而非水溶性。也可能是水提劑經(jīng)過高溫煎煮造成有效抗菌成分丟失。總而言之，4味草藥在體外表現(xiàn)了很強(qiáng)的抑制SA的活性，但是其能否在獸醫(yī)臨床上有效的防治葡萄球菌病尚需進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)。