張彩虹，林彥星，楊俊興，曹琛福，呂建強，黃超華，祁振強，林慶燕，花群義*

(1.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東深圳 518045；2.深圳市寶舜泰生物醫(yī)藥股份有限公司，廣東深圳 518101)

水皰性口炎(Vesicular stomatitis,VS)是由水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)引起的一種重要的人畜共患傳染病，在我國進境動物檢疫疫病名錄中列為二類傳染病[1-2]。馬、牛和豬是易感動物，綿羊、山羊和其他野生動物也可被感染。易感動物染病后臨床癥狀與口蹄疫、豬水皰性皮疹以及豬水皰病很難區(qū)分，因而實驗室診斷需要對這幾種傳染病進行鑒別診斷[3]。VSV分為2個血清型，即印第安納型(VSV-IND)和新澤西型(VSV-NJ)。VSV為單股負鏈RNA病毒，基因組全長約11 kb，依次排列著N、NS、M、G和L 5個基因，分別編碼核蛋白、磷蛋白、糖基化蛋白、糖蛋白和RNA聚合酶蛋白。水皰性口炎的存在與流行直接影響人類及動物健康，造成重大經(jīng)濟損失。隨著我國進口動物及動物產(chǎn)品貿(mào)易量的不斷增長，水皰性口炎傳入我國的風險不容忽視，一旦傳入將會給我國的養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失，因此建立快速高效的鑒別診斷方法對防止該病傳入具有重要的現(xiàn)實意義。

熒光定量PCR方法是將PCR與熒光檢測結(jié)合起來，具有高度的特異性、敏感性和準確性，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動物疫病診斷領(lǐng)域。直擴熒光定量PCR方法是利用一類經(jīng)過基因工程改造的高耐受的TaqDNA聚合酶，這類酶可以直接以全血、血清、尿液、水皰液、糞便、牛奶、動物組織等材料為模板，無需經(jīng)過核酸提取的步驟，經(jīng)一步PCR擴增到目的基因，從而顯著簡化檢測流程，節(jié)省時間和成本，提高檢測效率。目前國內(nèi)外已經(jīng)建立了多種檢測VSV核酸的PCR或熒光定量PCR方法[4-12]，本研究團隊也建立了一種可同時鑒別檢測VSV-IND和VSV-NJ的二重熒光定量PCR方法[13]。但目前還沒有檢測VSV直擴熒光定量PCR方法的報道，本研究以VSV兩種血清型編碼病毒RNA聚合酶的L基因為靶序列，分別設(shè)計特異性的引物和探針，通過對反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了一種鑒別檢測水皰性口炎病毒印第安納型和新澤西型的直擴熒光定量PCR方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株 水皰性口炎病毒IND型和NJ型滅活抗原從美國國家獸醫(yī)服務(wù)實驗室(NVSL)引進，由深圳出入境檢驗檢疫局動檢實驗室保存；FMDV O型疫苗株從云南保山疫苗廠引進；豬水皰病病毒(SVDV)、藍舌病病毒(BTV)、鹿流行性出血病病毒(EHDV)、小反芻獸疫病毒(PPRV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和豬瘟病毒(CSFV)的滅活抗原均由深圳出入境檢驗檢疫局動檢實驗室保存。

1.1.2 試劑 病毒RNA抽提試劑盒MagMAXTM-96 Viral RNA Isolation Kit (AM1836)購自美國ABI公司；Direct One-Step S/P qPCR Taqprobe Kit購自美國VitaNavi公司。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針 本文中所用到的引物和探針序列引用于本研究團隊林彥星等所建立的鑒別檢測VSV-IND和VSV-NJ的熒光定量PCR方法[13]，特異性擴增水皰性口炎病毒編碼病毒RNA聚合酶的L基因，引物與探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 直擴熒光定量PCR反應(yīng)體系的建立 采用直擴熒光定量PCR試劑盒，在25 μL反應(yīng)體系中包含以下成分：2×S/P qPCR mix、25×S/P qPCR Polymerases、模板、VSV-IND引物和探針(10 μmol/L)或VSV-NJ引物和探針(10 μmol/L)、Rox Reference Dye、DEPC水。應(yīng)用矩陣法對引物和探針的使用濃度進行篩選，以獲得最佳的擴增效果。

表1 VSV-IND和VSV-NJ L基因的引物和探針序列

本試驗在ABI 7500熒光PCR儀上進行，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴增曲線和CT值判定結(jié)果。VSV-NJ的反應(yīng)結(jié)果在FAM通道檢測，VSV-IND的檢測結(jié)果在HEX通道檢測。

1.2.3 直擴熒光定量PCR方法的特異性試驗 采用直擴熒光定量PCR方法，按照優(yōu)化后的反應(yīng)體系和最佳反應(yīng)條件，分別以VSV-IND、VSV-NJ、FMDV、SVDV、BTV、EHDV、PPRV、BVDV和CSFV的滅活抗原和BHK-21細胞培養(yǎng)液為模板，對該方法的特異性進行評估。

1.2.4 直擴熒光定量PCR方法的敏感性試驗 將VSV-IND和VSV-NJ的滅活抗原進行10倍系列稀釋，采用已優(yōu)化的直擴熒光定量PCR進行擴增，對該方法的敏感性進行評估，同時與常規(guī)的熒光定量PCR[13]進行比較。

1.2.5 直擴熒光定量PCR方法的重復性試驗 分別采用等量的4份不同濃度梯度的模板進行直擴熒光定量PCR試驗，每份模板每個濃度做3個重復，以確定該方法的組內(nèi)差異。在不同的時間段對4份不同濃度梯度的模板進行3次直擴熒光定量PCR試驗，以確定該方法的組間差異。

1.2.6 臨床樣品的檢測 采用本研究所建立的方法，對本室保存的200份臨床樣品進行檢測，并分別以VSV-IND和VSV-NJ滅活抗原為陽性對照，同時用本室建立的雙重熒光PCR方法[13]進行檢測，并對檢測結(jié)果進行比對。

2 結(jié)果

2.1 直擴熒光定量PCR方法的建立

通過對VSV-IND和VSV-NJ引物和探針濃度的優(yōu)化，最終確定25 μL反應(yīng)體系，2×S/P qPCR mix 12.5 μL，25×S/P qPCR Polymerases 1 μL，正反向引物各1 μL，探針0.5 μL，模板5 μL，Rox Reference Dye 0.5 μL，DEPC水 3.5 μL。熒光定量PCR循環(huán)條件為：55℃ 30 min，95℃ 5 min，然后94℃ 20 s，60℃ 40 s，進行40個循環(huán)，VSV-NJ在FAM通道進行結(jié)果分析，VSV-IND在HEX通道進行結(jié)果分析。結(jié)果顯示，以VSV-IND和VSV-NJ滅活抗原為模板進行檢測時分別在HEX和FAM通道出現(xiàn)典型的S型擴增曲線，BHK-21細胞培養(yǎng)液、空白對照無擴增，且VSV的兩個血清型之間無交叉反應(yīng)，即HEX通道只有VSV-IND滅活抗原出現(xiàn)典型的S型擴增曲線；FAM通道只有VSV-NJ滅活抗原出現(xiàn)典型的S型擴增曲線(圖1)。

2.2 直擴熒光定量PCR 的特異性試驗

采用已優(yōu)化的直擴熒光定量PCR反應(yīng)體系，分別以VSV-IND、VSV-NJ、FMDV、SVDV、BTV、EHDV、PPRV、BVDV和CSFV的滅活抗原和BHK-21細胞培養(yǎng)液為模板，進行直擴熒光定量PCR擴增。結(jié)果顯示，在FAM通道，只有VSV-NJ樣品呈典型的陽性擴增反應(yīng)；在HEX通道，只有VSV-IND樣品呈陽性擴增反應(yīng)，其他病毒對照和BHK細胞對照均呈陰性反應(yīng)(圖2)，表明所建立的方法特異性好，能準確鑒別檢測VSV-IND和VSV-NJ，且與其他能引起相似癥狀的病毒樣品無交叉反應(yīng)。

A.VSV-IND擴增曲線圖(HEX)；B.VSV-NJ擴增曲線圖(FAM)A.Amplification curve of VSV-IND (HEX); B.Amplification curve of VSV-NJ (FAM)

A.VSV-IND特異性結(jié)果(HEX)；B.VSV-NJ特異性結(jié)果(FAM)A.Specificity result of VSV-IND (HEX); B.Specificity result of VSV-NJ (FAM)

2.3 直擴熒光定量PCR 的敏感性試驗

結(jié)果顯示，建立的直擴熒光定量PCR方法對VSV-IND和VSV-NJ滅活抗原的檢測靈敏度均為10-5(圖3)，而常規(guī)的熒光PCR對同一份樣品的檢測靈敏性也為10-5，該方法的檢測靈敏性與傳統(tǒng)的先提核酸再進行熒光定量PCR[13]的靈敏性相當，說明所建立的方法具有良好的檢測靈敏度。

A.VSV-IND敏感性結(jié)果(HEX)；B.VSV-NJ敏感性結(jié)果(FAM)A.Sensitivity result of VSV-IND (HEX); B.Sensitivity result of VSV-NJ (FAM)

2.4 直擴熒光定量PCR的重復性試驗

VSV-IND和VSV-NJ分別選取4個稀釋度的滅活抗原進行直擴熒光定量PCR，每個稀釋度做3個重復，根據(jù)Ct值計算變異系數(shù)(CV)。組內(nèi)變異試驗結(jié)果顯示，VSV-IND檢測的變異系數(shù)為0.29%～1.14%，VSV-NJ檢測的變異系數(shù)為0.24%～1.83%；組間變異試驗結(jié)果顯示，VSV-IND檢測的變異系數(shù)為1.62%～2.12%，VSV-NJ檢測的變異系數(shù)為0.85%～1.92%，表明該方法重復性好(表2和圖4)。

表2 檢測VSV-IND和VSV-NJ的直擴熒光定量PCR重復性試驗結(jié)果

2.5 臨床樣品的檢測

分別用建立的直擴熒光定量PCR方法和常規(guī)的二重熒光PCR方法對200份豬血臨床樣品進行檢測，結(jié)果顯示，直擴熒光定量PCR方法僅陽性對照出現(xiàn)典型的擴增曲線，200份臨床樣品均無特異性擴增曲線，該結(jié)果與常規(guī)二重熒光PCR結(jié)果一致。

3 討論

本研究采用一種新型的TaqDNA聚合酶，建立了一種無需提取核酸，直接從樣品中進行目的基因擴增的可快速鑒別檢測VSV-IND和VSV-NJ的直擴熒光定量PCR方法。

在傳統(tǒng)的熒光定量PCR方法中，由于其DNA聚合酶的活性受各種各樣樣品(如血液、動植物組織、飼料、食物)中抑制因子(如血紅蛋白、高鐵血紅素、乳鐵蛋白等)的影響，在進行檢測時，必須先從待測樣本中分離純化核酸。目前雖然有多家公司推出了自動或半自動的核酸提取工作站，顯著節(jié)省了人力成本，但核酸提取的費用顯著增加，尤其是很多基層檢測實驗室難以配備價格昂貴的全自動核酸提取儀。而直擴熒光定量PCR法則避免了這一難題，該技術(shù)的優(yōu)勢是采用高耐受性的DNA聚合酶，無需提取核酸，可直接從樣品中擴增目的基因，從而簡化了PCR的步驟，克服了傳統(tǒng)熒光定量PCR中存在的成本高、效率低、易造成交叉污染等問題。目前該方法已經(jīng)應(yīng)用于動物疫病病原的檢測[14-15]。

特異性、敏感性和檢測速度是考查熒光定量PCR的3項重要指標，本研究設(shè)計的引物和探針特異性良好，不僅可以鑒別檢測2種血清型的VSV，而且與其他能引起相似癥狀的病毒無交叉反應(yīng)。就檢測的敏感性來說，本方法的敏感性與傳統(tǒng)的熒光定量PCR相當，對10倍系列稀釋的VSV-IND和VSV-NJ的滅活抗原檢測的敏感性均為10-5。在保證了方法的特異性和敏感性的前提下，本方法無需提取核酸，比傳統(tǒng)的熒光定量PCR節(jié)省了提取核酸的時間、人力和物力，在檢測速度方面明顯略勝一籌，而且避免了核酸提取過程中可能發(fā)生的污染問題。水皰性口炎為一種外來動物疫病，目前國內(nèi)還未見該病發(fā)生的報道，因此用該方法對200份臨床樣品進行檢測時，結(jié)果均為陰性，與常規(guī)熒光定量PCR檢測結(jié)果一致。本研究建立的鑒別檢測VSV-NJ和VSV-IND的直擴熒光定量PCR方法，具有良好的特異性、敏感性和重復性，為VSV的檢測、檢疫、食品安全檢驗和VSV分子生物學研究提供了一種新的方法，也為在同一管內(nèi)對VSV的2個血清型進行直擴熒光定量PCR鑒別檢測研究奠定了基礎(chǔ)。