王 瀟，曹琛福，黃超華，林彥星，花群義，賈偉新

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642；2.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳 518045)

禽流感是由禽流感病毒引起的一種急性、高度接觸性的傳染病。不同年齡、品種的家禽感染禽流感病毒后，會(huì)表現(xiàn)出不同的臨床癥狀[1-2]。根據(jù)禽流感病毒毒力強(qiáng)度的不同可分為高致病性禽流感病毒和低致病性禽流感病毒，禽流感病毒H7亞型屬于高致病性禽流感病毒。2013年，一種新的可感染人的禽流感病毒H7N9在我國(guó)長(zhǎng)江三角洲地區(qū)暴發(fā)。自禽流感病毒H7N9暴發(fā)以來(lái)，禽流病毒感染導(dǎo)致人死亡的案例越來(lái)越多，對(duì)我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展和社會(huì)的安定造成了極大的危害[3]。2017年，我國(guó)因感染禽流感病毒H7N9死亡的人數(shù)又急劇上升，再次引起了大家的關(guān)注。因此，建立一種快速檢測(cè)禽流感病毒H7亞型的方法對(duì)我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)及公共衛(wèi)生事業(yè)具有重要意義。

目前常用病毒分離法和PCR方法檢測(cè)禽流感病毒H7亞型，但是這些方法無(wú)法運(yùn)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，同時(shí)操作復(fù)雜，且耗時(shí)長(zhǎng)。2006年，Piepenburg O等[4-6]報(bào)道了重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification,RPA)技術(shù)，該技術(shù)操作簡(jiǎn)單且快速，在37℃～42℃恒溫條件下，20 min即能完成核酸的擴(kuò)增，得到檢測(cè)結(jié)果。英國(guó)TwistDx公司開(kāi)發(fā)出了商品化試劑盒，反應(yīng)酶是以凍干粉形式儲(chǔ)存，促進(jìn)了重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。本試驗(yàn)通過(guò)選取禽流感病毒H7亞型的HA基因保守序列為靶標(biāo)，建立檢測(cè)禽流感病毒H7亞型的RT-exoRPA檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試劑 熒光定量PCR儀，ABI公司產(chǎn)品；超微量核酸蛋白濃度分析儀，BioDrop公司產(chǎn)品；磁珠法核酸提取純化系統(tǒng)，病毒RNA抽提試劑盒MagMAX-96 Viral RNA Isolation Kit(AM1836)，Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；T16-ISO等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)儀，TwistAmpTM EXO試劑盒，TwistDx公司產(chǎn)品；實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)母液，Ambion公司產(chǎn)品。

1.1.2 樣品 禽流感病毒H1亞型、H3亞型、H4亞型、H5亞型、H7亞型、H9亞型和H11亞型，新城疫病毒均為滅活病毒，35份臨床樣品均來(lái)自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院禽病研究室。

1.2 方法

1.2.1 引物探針的設(shè)計(jì)與合成 選用最近流行的禽流感病毒H7亞型毒株的HA基因保守序列，根據(jù)RPA要求設(shè)計(jì)多對(duì)引物和探針，在HA基因保守區(qū)段自主設(shè)計(jì)多對(duì)引物及探針，并經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST驗(yàn)證其特異性，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成與標(biāo)記，其中在IVP-exoRPA探針上需要作如下標(biāo)記：第32個(gè)堿基修飾BHQ1-dT，第36個(gè)堿基修飾6-FAM-dT，第34個(gè)堿基替換為dSpacer，3′端修飾C3 Spacer。

1.2.2 病毒RNA的提取及濃度測(cè)定 按Thermo病毒RNA抽提試劑盒(MagMAX-96 Viral RNA Isolation Kit，AM1836)說(shuō)明于全自動(dòng)磁珠提取純化系統(tǒng)上提取禽流感病毒H1亞型、H3亞型、H4亞型、H5亞型、H7亞型、H9亞型和H11亞型、新城疫病毒的核酸，利用超微量核酸蛋白濃度分析儀測(cè)定核酸濃度。

1.2.3 RT-exoRPA反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 將29.5 μL溶解緩沖液(rehydration buffer)，2.1 μL 10 μmol 的上、下游引物，0.6 μL 10 μmol的探針，13.2 μL模板及DEPC水，混勻后，加入TwistAmpTMexo試劑盒中裝有白色固體凍干混合酶顆粒的RPA反應(yīng)管中，最后再加入2.5 μL 280 mmol醋酸鎂，共50 μL體系。將配置好的反應(yīng)體系置于T16-ISO儀器中，在37℃～42℃反應(yīng)5 min后，取出混勻后，重新放入T16-ISO儀器中繼續(xù)反應(yīng)15 min。同時(shí)在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中收集FAM熒光。

1.2.4 最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的確定

1.2.4.1 最佳引物及探針的篩選 將多對(duì)上、下游引物及探針進(jìn)行配對(duì)組合，配置反應(yīng)體系，加入模板為同一禽流感病毒H7亞型核酸，進(jìn)行特異性試驗(yàn)和靈敏性試驗(yàn)，篩選出最佳組合。

1.2.4.2 最佳反應(yīng)溫度的確定 將反應(yīng)溫度分別設(shè)置為37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃共6個(gè)不同溫度進(jìn)行試驗(yàn)，篩選出最佳的反應(yīng)溫度。

1.2.5 檢測(cè)禽流感病毒H7亞型RT-exoRPA方法的特異性試驗(yàn) 按優(yōu)化好的條件，以禽流感病毒H1亞型、H3亞型、H4亞型、H5亞型、H7亞型、H9亞型、H11亞型、新城疫病毒為模板，進(jìn)行特異性擴(kuò)增，檢測(cè)其特異性。

1.2.6 檢測(cè)禽流感病毒H7亞型RT-exoRPA方法的靈敏性試驗(yàn) 將禽流感病毒H7亞型核酸10倍倍比稀釋后，用RT-exoRPA方法進(jìn)行靈敏性試驗(yàn)并與實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行比較，以新城疫病毒核酸為陰性對(duì)照。實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法反應(yīng)體系包括：2×RT-PCR buffer 12.5 μL，5×RT-PCR酶1 μL，上、下引物各1 μL，探針0.4 μL，最后加DEP水及模板至25 μL。引物及探針為采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《禽流感H7亞型熒光RT-PCR檢測(cè)方法》(GB/T 19438.3-2004)推薦的核苷酸序列。反應(yīng)程序：45℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；95℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 45 s(收集熒光FAM)，40個(gè)循環(huán)。

1.2.7 臨床試驗(yàn) 利用本文所建立檢測(cè)方法對(duì)采自某家禽交易市場(chǎng)35份咽拭子樣品進(jìn)行檢測(cè)，以H7亞型禽流感病毒核酸為陽(yáng)性對(duì)照，新城疫病毒核酸為陰性對(duì)照，同時(shí)，用實(shí)時(shí)熒光RT-RPA方法對(duì)該批樣品進(jìn)行檢測(cè)，比較兩者的符合性。

2 結(jié)果

2.1 最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的確定

通過(guò)靈敏性試驗(yàn)和特異性試驗(yàn)對(duì)引物及探針進(jìn)行篩選，最終確定最佳引物探針的核酸序列見(jiàn)表1。表格中IVP-exoRPA 探針修飾標(biāo)記為：①第32個(gè)堿基修飾BHQ1-dT；②第36個(gè)堿基修飾6-FAM-dT；③第34個(gè)堿基替換為dSpacer；④3′端修飾C3 Spacer。用同一禽流感病毒H7亞型核酸作為模板進(jìn)行試驗(yàn)，篩選最佳反應(yīng)溫度。試驗(yàn)結(jié)果表明將反應(yīng)溫度設(shè)置為40℃時(shí)，其熒光吸收值增長(zhǎng)率最高，因此40℃為最佳反應(yīng)溫度。

表1 RT-exoRPA方法最佳引物及探針核苷酸序列

2.2 RT-exoRPA方法靈敏性結(jié)果

將禽流感病毒H7亞型進(jìn)行10倍倍比稀釋?zhuān)雌浜怂釢舛葹?.24 μg/mL至0.24×10-5μg/mL，分別用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和RT-exoRPA兩種檢測(cè)方法進(jìn)行靈敏性試驗(yàn)。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示(圖1)，有6條標(biāo)準(zhǔn)“S”曲線出現(xiàn)，其禽流感病毒H5亞型核酸濃度分別為：0.24、0.24×10-1、0.24×10-2、0.24×10-3、0.24×10-4、0.24×10-5μg/mL，對(duì)應(yīng)的CT值分別為：19.2、23.0、27.2、30.2、34.0、37.3 。根據(jù)試劑盒中陰陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)CT<35，并出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)“S”曲線時(shí)判為陽(yáng)性，當(dāng)CT≥35時(shí)判為陰性。因此在本次試驗(yàn)中實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法最低可檢測(cè)到核酸濃度為0.24×10-4μg/mL。RT-exoRPA靈敏性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示(圖2)，樣品濃度為0.24、0.24×10-1、0.24×10-2、0.24×10-3μg/m時(shí)，出現(xiàn)核酸擴(kuò)增曲線，因此，在本次試驗(yàn)中RT-exoRPA方法最低可檢測(cè)到核酸濃度為0.24×10-3μg/mL。結(jié)果表明RT-exoRPA方法靈敏性比實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法低一個(gè)數(shù)量級(jí)。但RT-exoRPA方法檢測(cè)時(shí)間只需要20 min，在5 min可觀察到擴(kuò)增曲線，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)時(shí)間為88 min，因此RT-exoRPA方法更為快速。

2.3 RT-exoRPA方法特異性結(jié)果

按優(yōu)化好的條件，驗(yàn)證該方法的特異性。結(jié)果顯示(圖3)，只有禽流感病毒H7亞型樣品出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，而其樣品均無(wú)擴(kuò)增曲線。因此本文建立的檢測(cè)禽流感病毒H7亞型RT-exoRPA檢測(cè)方法特異性強(qiáng)。

2.4 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

將35份田間樣品提取核酸后，按本文建立的RT-exoRPA檢測(cè)方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分別進(jìn)行檢測(cè)，RT-exoRPA方法檢測(cè)結(jié)果(圖4～圖9)顯示，有10份樣品為陽(yáng)性，其余25份樣品為陰性，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)結(jié)果一致，表明兩種方法符合率100%。

1～6.禽流感病毒H7亞型核酸濃度分別為0.24、0.24×10-1、0.24×10-2、0.24×10-3、0.24×10-4、0.24×10-5μg/mL；7.陰性對(duì)照

1-6.H7 subtype avian influenza virus nucleic acid concentrations 0.24,0.24×10-1，0.24×10-2,0.24×10-3,0.24×10-4,0.24×10-5μg/mL;7.Negative control

圖1實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)結(jié)果

Fig.1 Detection results of real-time PCR method

1～6.禽流感病毒H7亞型核酸濃度分別為 0.24、0.24×10-1、0.24×10-2、0.24×10-3、0.24×10-4、0.24×10-5μg/mL；7.陰性對(duì)照

1-6.H7 subtype avian influenza virus nucleic acid concentrations:0.24,0.24×10-1，0.24×10-2,0.24×10-3,0.24×10-4,0.24×10-5μg/mL;7.Negative control

圖2 RT-exoRPA方法檢測(cè)結(jié)果

Fig.2 Detection results of RT-exoRPA method

3 討論

禽流感一直威脅著我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，特別是高致病性禽流感更是造成我國(guó)大批家禽死亡，如今部分禽流感亞型甚至已經(jīng)威脅到了人類(lèi)的健康，影響到了社會(huì)的安定。當(dāng)前我國(guó)H7亞型禽流感流行毒株復(fù)雜多樣，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)疫病的防控帶來(lái)了挑戰(zhàn)[7]。若能做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早控制，則可有效阻止疫病的傳播以及減少經(jīng)濟(jì)損失。

1.禽流感病毒H1亞型；2.禽流感病毒H3亞型；3.禽流感病毒H4亞型；4.禽流感病毒H5亞型；5.禽流感病毒H7亞型；6.禽流感病毒H9亞型；7.禽流感病毒H11亞型；8.新城疫病毒

1.H1 subtype avian influenza virus;2.H3 subtype avian influenza virus;3.H4 subtype avian influenza virus;4.H5 subtype avian influenza virus;5.H7 subtype avian influenza virus;6.H9 subtype avian influenza virus;7.H11 subtype avian influenza virus;8.Newcastle disease virus

圖3 RT-exoRPA檢測(cè)特異性結(jié)果

Fig.3 Specificity detection results of RT-exoRPA method

1～6.待檢樣品1號(hào)～6號(hào)；7.陰性對(duì)照；8.陽(yáng)性對(duì)照1-6.Samples 1-6；7.Negative control；8.Positive control

1～6.待檢樣品7號(hào)～12號(hào)；7.陰性對(duì)照；8.陽(yáng)性對(duì)照1-6.Samples 7-12；7.Negative control；8.Positive control

1～6.待檢樣品13號(hào)～18號(hào)；7.陰性對(duì)照；8.陽(yáng)性對(duì)照1-6.Samples 13-18；7.Negative control；8.Positive control

1～6.待檢樣品19號(hào)～24號(hào)；7.陰性對(duì)照；8.陽(yáng)性對(duì)照1-6.Samples 19 -24；7.Negative control；8.Positive control

1～6.待檢樣品25號(hào)～30號(hào)；7.陰性對(duì)照；8.陽(yáng)性對(duì)照1-6.Samples 25-30；7.Negative control；8.Positive control

目前診斷禽流感病毒H7亞型的方法很多，實(shí)驗(yàn)室常用病毒分離法診斷禽流感病毒H7亞型，但是該方法耗時(shí)長(zhǎng)；普通RT-PCR方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，依賴溫度變化才能擴(kuò)增，不適合現(xiàn)場(chǎng)診斷[8]；RT-PLAMP方法，雖在恒溫條件下即可擴(kuò)增，但該方法引物設(shè)計(jì)復(fù)雜，且需要多對(duì)[9]。因此，建立一種簡(jiǎn)單、快速檢測(cè)禽流感病毒H7亞型的方法具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

RPA一種新型的恒溫?cái)U(kuò)展核酸檢測(cè)方法，其工作原理是模仿機(jī)體內(nèi)核酸復(fù)制機(jī)制，通過(guò)一些特殊的重組蛋白(酶)，讓DNA雙螺旋解鏈后，又通過(guò)幫助聚合酶復(fù)制DNA達(dá)到擴(kuò)增的目的[10]。

1～5.待檢樣品31號(hào)～35號(hào)；6.陰性對(duì)照；7.陽(yáng)性對(duì)照1-5.Samples 31-35；6.Negative control；7.Positive control

由于RPA技術(shù)克服了實(shí)時(shí)熒光定量PCR依賴變溫才能得到擴(kuò)增的特點(diǎn)以及具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速，且反應(yīng)酶可以干粉形式保存[9]等特點(diǎn)。自2006年，RPA技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，該技術(shù)先已廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域[12-15]。

本文根據(jù)禽流感病毒H7亞型HA基因保守序列，設(shè)計(jì)多對(duì)引物探針，通過(guò)篩選后構(gòu)建了快速檢測(cè)禽流感病毒H7亞型RT-exoRPA方法，并對(duì)其特異性和靈敏性也進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明，該方法具有簡(jiǎn)便、快速、特異、靈敏等特點(diǎn)。在靈敏性試驗(yàn)中，RT-exoRPA方法的靈敏性比實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法相差一個(gè)數(shù)量級(jí)，可能與RT-exoRPA在擴(kuò)增體系中一些蛋白酶的干擾所產(chǎn)生[16]，也可能與設(shè)計(jì)的引物探針不夠靈敏有關(guān)。相信在RPA檢測(cè)技術(shù)的不斷研究中，這些問(wèn)題能得到改善，將RPA檢測(cè)方法更好地運(yùn)用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)中。