江 楓， 劉 麗， 張 公 亮,2， 侯 紅 漫,2

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 遼寧省水產(chǎn)品加工質(zhì)量安全與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

群體感應(yīng)是細(xì)菌細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)和基因調(diào)控機(jī)制，能引起細(xì)菌致病性和食品腐敗變質(zhì)。因此，阻斷細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)可以抑制群體感應(yīng)控制的表型(例如：生物發(fā)光、生物膜形成、胞外酶合成)表達(dá)，控制食品的腐敗。有研究表明，群體感應(yīng)系統(tǒng)參與生物膜形成的所有階段，調(diào)節(jié)種群密度和成熟的生物膜內(nèi)的代謝活動(dòng)，以適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)需求和現(xiàn)有資源[1]。群體感應(yīng)抑制劑(quorum sensing inhibitor，QSI)是指化學(xué)穩(wěn)定的、高效的低分子質(zhì)量分子，其對(duì)群體感應(yīng)控制的表型顯示出高度的特異性且沒有毒性副作用[2]。

白藜蘆醇是一種天然高效的抗生物膜活性制劑，Augustine等[3]首次報(bào)道亞抑菌濃度白藜蘆醇能顯著抑制V.cholerae生物被膜形成；Lee等[4]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能有效抑制大腸桿菌和銅綠假單胞菌生物膜形成。而白藜蘆醇對(duì)水產(chǎn)品中優(yōu)勢(shì)腐敗菌生物膜的影響報(bào)道較少。

蜂房哈夫尼菌在冷凍牛肉、雞肉、生牛奶和魚糜制品等食品腐敗期間是一種主要的優(yōu)勢(shì)腐敗細(xì)菌，在微生物食物腐敗中起重要作用。前期工作已發(fā)現(xiàn)蜂房哈夫尼菌具有生物膜形成能力，本實(shí)驗(yàn)探究白藜蘆醇對(duì)分離自即食海參的蜂房哈夫尼菌的抗生物膜活性，以期為進(jìn)一步探究群體感應(yīng)系統(tǒng)與生物膜的形成關(guān)系奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

結(jié)晶紫染色液，PBS，標(biāo)準(zhǔn)品C6-HSL，白藜蘆醇，MH(B)培養(yǎng)基，卡那霉素；酶標(biāo)儀。

1.2 方 法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 10 g/L；pH (7.0±0.2)。STA瓊脂培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂0.65%；pH (7.0±0.2)。Swimming培養(yǎng)基：蛋白胨1%，氯化鈉0.25%，瓊脂0.3%，均在121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 菌種的復(fù)蘇

菌種：蜂房哈夫尼菌、紫色桿菌CV026。

將蜂房哈夫尼菌平板劃線，30 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h，挑取單菌落于100 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)18～24 h，制備成種子液。

將紫色桿菌CV026接種于100 mL無(wú)菌LB培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)16 h，取1 mL 菌液轉(zhuǎn)接至含20 μg/mL卡那霉素的100 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16～18 h。

1.2.3 最低抑菌濃度的測(cè)定

通過改良的微量肉湯稀釋法測(cè)定最低抑菌濃度，分別檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)蜂房哈夫尼菌、紫色桿菌CV026的最低抑菌濃度(MIC)。

最低抑菌濃度：以在小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)所需的最小藥物濃度作為最低抑菌濃度。

1.2.4 報(bào)告菌平板法檢測(cè)白藜蘆醇及抑菌實(shí)驗(yàn)

按照?qǐng)?bào)告菌平板法定性檢測(cè)QSI[5]。

1.2.5 紫色桿菌素提取法定量檢測(cè)白藜蘆醇及抑菌試驗(yàn)

按照紫色桿菌素提取法定量檢測(cè)QSI[6]。將CV026菌液、C6-HSL和不同濃度白藜蘆醇分別混合后，加入96微孔板中。28 ℃培養(yǎng)48 h，將孔板水分烘干。向各孔中加入DMSO，搖床振蕩2 h，使紫色桿菌素溶出，測(cè)定OD590。

抑菌實(shí)驗(yàn)時(shí)LB肉湯中不添加C6-HSL，其余過程同上，培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD600。

1.2.6 白藜蘆醇對(duì)蜂房哈夫尼菌生物膜形成的影響

通過結(jié)晶紫染色法[7]測(cè)定白藜蘆醇對(duì)蜂房哈夫尼菌生物膜形成的影響。在96孔板中依次加入LB肉湯、不同濃度白藜蘆醇和蜂房哈夫尼菌液，陽(yáng)性對(duì)照孔不加白藜蘆醇，30 ℃培養(yǎng)24 h后測(cè)定菌液OD600。去除孔板中的浮游細(xì)菌，用PBS洗滌，再用無(wú)水甲醇固定、結(jié)晶紫染色，加入冰醋酸溶解后測(cè)定OD590。通過生物膜成膜量評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)判斷其生物膜形成能力。

1.2.7 白藜蘆醇對(duì)蜂房哈夫尼菌游動(dòng)能力的影響

在Swimming培養(yǎng)基中分別加入不同濃度白藜蘆醇為實(shí)驗(yàn)組，以加生理鹽水作為陽(yáng)性對(duì)照[8]。取3 μL蜂房哈夫尼菌液點(diǎn)到平板中央，于30 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定擴(kuò)散圈直徑。

2 結(jié)果與討論

2.1 白藜蘆醇對(duì)蜂房哈夫尼菌的抑菌活性

如圖1所示，經(jīng)30 ℃培養(yǎng)24 h后，白藜蘆醇對(duì)蜂房哈夫尼菌的抑制活性隨濃度增加而增強(qiáng)；在256 μg/mL時(shí)能完全抑制蜂房哈夫尼菌的生長(zhǎng)(P<0.01)，因此白藜蘆醇對(duì)蜂房哈夫尼菌的最低抑菌濃度為256 μg/mL。

圖1 白藜蘆醇對(duì)蜂房哈夫尼菌的抑制作用

2.2 白藜蘆醇對(duì)CV026的抑菌活性

如圖2所示，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，隨著質(zhì)量濃度的增加，白藜蘆醇對(duì)CV026抑制活性逐漸增強(qiáng)；當(dāng)白藜蘆醇質(zhì)量濃度為128 μg/mL時(shí)，能完全抑制CV026的生長(zhǎng)(P<0.01)?？梢姲邹继J醇對(duì)紫色桿菌CV026最低抑菌濃度為128 μg/mL，以下實(shí)驗(yàn)均在白藜蘆醇的亞抑菌濃度下進(jìn)行。

圖2 白藜蘆醇對(duì)CV026抑菌作用

2.3 CV026定性檢測(cè)白藜蘆醇抑制效果

CV026中紫色桿菌素的產(chǎn)生受群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控，若樣品中含有群體感應(yīng)抑制劑，將抑制CV026產(chǎn)生紫色，在小孔周圍出現(xiàn)白色、渾濁且不透明的抑制圈。抑制圈的直徑隨濃度增加而增加，如圖3所示。白藜蘆醇產(chǎn)生了這種特異性的特征圈(圖3(a))。對(duì)照組(圖3(b))小孔周圍沒有產(chǎn)生抑菌圈，說(shuō)明白藜蘆醇可以干擾群體感應(yīng)系統(tǒng)。從圖3(a)中可知，特征圈直徑隨白藜蘆醇濃度降低而減小。對(duì)溶劑DMSO進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其未含有群體感應(yīng)抑制劑作用和抑菌作用。

1～4，ρ=16，8，4，2 μg/mL；CK，二甲基亞砜

2.4 CV026定量檢測(cè)白藜蘆醇抑制效果

選擇4種不同亞抑菌濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如圖4所示。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，白藜蘆醇在16 μg/mL 時(shí)顯著抑制CV026產(chǎn)紫色桿菌素的能力(P<0.01)。隨著白藜蘆醇質(zhì)量濃度的增大，其對(duì)紫色桿菌素產(chǎn)量的抑制率逐漸增大，抑制率從18.5%升高到74.9%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Truchado等[9]的基本一致。為確定對(duì)紫色桿菌素產(chǎn)量的抑制并不是抑菌活性的作用，測(cè)定了白藜蘆醇對(duì)CV026生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，白藜蘆醇不影響CV026的生長(zhǎng)。

圖4 白藜蘆醇對(duì)紫色桿菌素產(chǎn)量的抑制作用

2.5 白藜蘆醇對(duì)蜂房哈夫尼菌生物膜形成的抑制作用

如圖5所示，蜂房哈夫尼菌在不同質(zhì)量濃度白藜蘆醇作用下能夠顯著抑制蜂房哈夫尼菌生物膜的形成(P<0.01)，最大抑制率達(dá)到79.1%，沒有生物膜產(chǎn)生。圖5還顯示，浮游菌的OD不隨白藜蘆醇質(zhì)量濃度的增加而改變，這證明白藜蘆醇的生物膜抑制活性并不是由于其抗菌活性的作用。但是生物膜中細(xì)菌的OD會(huì)隨白藜蘆醇質(zhì)量濃度的增大而減小。

圖5 白藜蘆醇對(duì)蜂房哈夫尼菌生物膜形成的抑制作用

Fig.5 Inhibition of the biofilm formation ofH.alveiby resveratrol

2.6 白藜蘆醇抑制蜂房哈夫尼菌游動(dòng)能力

蜂房哈夫尼菌生物膜形成過程中，依賴于鞭毛運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力和生物膜形成密切相關(guān)，并同時(shí)受到群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控，干擾細(xì)菌鞭毛的合成過程能影響細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)和定植能力，細(xì)胞的游動(dòng)能力對(duì)其生物被膜的形成具有十分重要的作用[10]。如表1所示，在亞抑菌濃度下，白藜蘆醇能顯著抑制蜂房哈夫尼菌群體感應(yīng)依賴的游動(dòng)能力(P<0.01)。在質(zhì)量濃度為16 μg/mL時(shí)，最大抑制率達(dá)到74.1%。如圖6所示，隨著白藜蘆醇質(zhì)量濃度逐漸增大，蜂房哈夫尼菌遷移距離縮短，游動(dòng)能力逐漸降低。

表1 不同質(zhì)量濃度白藜蘆醇對(duì)蜂房哈夫尼菌的作用

Tab.1 The effect of different concentrations of resveratrol onH.alvei

ρ/(μg·mL-1)d/mm抑制率/%OD600062.1±0.300.68±0.20243.3±0.530.20.69±0.10438.2±0.438.50.69±0.30830.4±0.651.00.69±0.101616.1±0.274.10.69±0.20

圖6 白藜蘆醇對(duì)蜂房哈夫尼菌游動(dòng)能力抑制作用

3 結(jié) 論

白藜蘆醇在亞抑菌濃度下，能夠抑制由群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控的紫色桿菌CV026中紫色桿菌素的產(chǎn)量，并且具有濃度依賴性，當(dāng)質(zhì)量濃度為16 μg/mL 時(shí)紫色桿菌素產(chǎn)量最低，表明其具有群體感應(yīng)抑制作用；白藜蘆醇還能抑制蜂房哈夫尼菌生物膜形成及游動(dòng)能力，質(zhì)量濃度為16 μg/mL時(shí)抑制作用最大。研究結(jié)果為控制食品腐敗、提高食品安全奠定研究基礎(chǔ)。