徐 志 超， 王 璐， 李 靜， 孫 銘 琦， 葉 淑 紅

( 大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

鏈格孢霉菌能侵染蘋果葉片引起葉片黑斑病和落葉病，同時在蘋果植株中定殖，在花期侵染花朵從而導(dǎo)致后期果實患霉心病[1]?；加忻剐牟〉奶O果在貯藏過程中易出現(xiàn)霉變腐爛現(xiàn)象，造成嚴重的經(jīng)濟損失[2]。目前常用的蘋果霉心病的防治措施主要包括物理套袋和使用化學(xué)制劑，但物理套袋方法處理不當(dāng)會導(dǎo)致雨季果實腐爛，而化學(xué)藥劑防治存在農(nóng)殘的弊端，故生物防治無毒害等優(yōu)勢越來越引起人們的關(guān)注。

內(nèi)生菌是從植物組織中分離出的內(nèi)生細菌或真菌，能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的生理活性成分[3]。研究表明，多數(shù)植物內(nèi)生菌具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤等生理功能[4-5]，考慮篩選具有抑菌效果的植物內(nèi)生菌作為生防菌株，應(yīng)用于蘋果霉心病的防治。銀杏是一種藥食同源的植物，其提取物中的化學(xué)成分有200多種，主要包括黃酮類、萜內(nèi)酯類、有機酸類等生物活性成分[6]。王祖華等[9]篩選的銀杏內(nèi)生細菌拮抗菌株次級代謝產(chǎn)物對灰霉菌具有明顯的抑制作用。對銀杏內(nèi)生真菌的拮抗作用已有研究，但對內(nèi)生細菌的研究還不夠深入。課題組前期從不同區(qū)域銀杏分離得到銀杏內(nèi)生細菌，實驗結(jié)果表明其具有廣譜的抑菌能力[8]。本實驗旨在研究銀杏內(nèi)生菌對蘋果鏈格孢霉的抑制作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏內(nèi)生細菌、蘋果鏈格孢霉菌，實驗室前期分離保存；肉湯培養(yǎng)基，PDA、PD培養(yǎng)基；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)/丙二醛(MOA)試劑盒，南京建成生物工程研究所有限公司。

PHS-3C pH計，TGL-16M高速冷凍離心機，DDS-307A電導(dǎo)率儀，Thermo酶標儀。

1.2 方 法

1.2.1 目標菌株的篩選

選取實驗室保藏的10株銀杏內(nèi)生菌，活化制備菌液(106～108CFU/mL)，接種于肉湯培養(yǎng)液體發(fā)酵，取發(fā)酵上清液涂布于PDA平板；接種培養(yǎng)5 d的蘋果鏈格孢霉菌菌餅(直徑6 mm)于30 ℃培養(yǎng)3 d，用十字交叉法測定鏈格孢霉菌落直徑[9]。

1.2.2 目標菌株的形態(tài)及生理生化鑒定

分別通過淀粉水解實驗、油脂水解實驗、石蕊牛乳實驗檢測生理生化指標[10-11]。

1.2.3 發(fā)酵液的制備

目標菌株Q7活化培養(yǎng)12 h后，以2%接種量接入肉湯培養(yǎng)基，28 ℃、120 r/min培養(yǎng)3 d。發(fā)酵液于8 000 r/min低溫離心15 min，取上清液于0.22 μm濾膜過濾，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 菌株Q7對蘋果鏈格孢霉的抑制作用

1.2.4.1 對蘋果鏈格孢霉細胞膜通透性的影響

稱取5 g菌絲體接入100 mL PD培養(yǎng)液中，處理組為PD培養(yǎng)基中加入2 mL發(fā)酵液，對照組中加等量無菌水，于30 ℃、20 r/min培養(yǎng)，測定不同時間的電導(dǎo)率[12]。

1.2.4.2 對蘋果鏈格孢霉細胞膜丙二醛含量的影響

稱取1.5 g菌絲體接入100 mL PD培養(yǎng)基，30 ℃、120 r/min培養(yǎng)3 d，加入菌株Q7發(fā)酵液2 mL，加入等量無菌水作對照，于不同時間測定丙二醛含量[13]。

1.2.4.3 對蘋果鏈格孢霉細胞內(nèi)代謝酶的影響

發(fā)酵液制備同“1.2.4.1”，于不同時間取適量菌體用蒸餾水沖洗后，用濾紙吸干表面水分，準確稱量濕菌體質(zhì)量，按質(zhì)量比1∶9加入生理鹽水，并加石英砂研磨，4 000 r/min 離心，上清液即為10%組織勻漿，加入等量無菌水作對照。使用試劑盒測定相關(guān)代謝的酶活力。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標菌株的篩選

考察10株銀杏內(nèi)生細菌的抑菌性，如表1所示。選定的內(nèi)生菌對蘋果鏈格孢霉均表現(xiàn)出較高的抑制效果，其中Q7的抑制效果最強，因此將Q7作為目標菌株進行生理生化鑒定并研究其對蘋果鏈格孢霉的抑制作用。

表1 10株內(nèi)生菌對蘋果鏈格孢霉的抑制作用

2.2 目標菌形態(tài)及生理生化鑒定

鏡檢結(jié)果如圖1所示，Q7革蘭氏染色呈陰性，菌體形態(tài)呈桿狀。平板培養(yǎng)菌落形態(tài)呈規(guī)則圓點，表面光滑，較透明。

生理生化結(jié)果表明，Q7對淀粉和油脂的水解能力弱，石蕊牛乳顏色變暗，發(fā)酵液呈偏堿性。初步鑒定銀杏內(nèi)生菌Q7屬于芽孢桿菌屬B.subtilis。

圖1 菌體B. subtilis Q7的鏡檢結(jié)果

2.3 B. subtilis Q7對蘋果鏈格孢霉的抑制性

2.3.1B.subtilisQ7對蘋果鏈格孢霉細胞膜通透性的影響

生物細胞膜是一種具有選擇性的半透膜，有些抗菌物質(zhì)能夠破壞細胞膜的通透性，從而干擾細胞正常的物質(zhì)運輸[12]。

由圖2可知，處理組電導(dǎo)率遠高于對照組，說明B.subtilisQ7對鏈格孢霉細胞膜的破壞較嚴重。處理組前2 h電導(dǎo)率迅速升高，說明鏈格孢霉細胞膜遭到嚴重破壞，胞內(nèi)電解質(zhì)外泄，培養(yǎng)液電導(dǎo)率升高[14]。隨后鏈格孢霉出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，修護被破壞的細胞，表現(xiàn)在4 h后電導(dǎo)率略有降低，隨著時間的延長電導(dǎo)率略有升高至基本趨于穩(wěn)定。

圖2 B. subtilis Q7對細胞膜通透性的影響

2.3.2B.subtilis. Q7對蘋果鏈格孢霉脂質(zhì)過氧化的影響

丙二醛(MDA)是細胞遭受逆境傷害時膜脂過氧化程度大小的主要指標之一[15]。處理組菌絲體中MDA含量明顯提高。如圖3所示，在9 h達到峰值，比對照組高50%，說明此時處理組菌絲體膜脂過氧化程度最嚴重，MDA積累量達到最大。9 h后，處理組MDA含量降低，說明蘋果鏈格孢霉對逆境脅迫的抵御作用減弱，細胞活性降低，在24 h后基本處于穩(wěn)定狀態(tài)。

圖3 B. subtilis Q7對細胞膜MDA質(zhì)量摩爾濃度的影響

2.3.3B.subtilisQ7對蘋果鏈格孢霉SOD的影響

如圖4所示，前3 h處理組SOD酶活力變化與對照組變化趨勢基本相同，3 h后處理組SOD活力顯著提高，這表明鏈格孢霉在逆境脅迫下，機體做出應(yīng)答反應(yīng)，通過協(xié)調(diào)酶的活性來保護細胞不受外界環(huán)境的影響[13]。隨著時間的延長，SOD活力開始減低，在20 h低于正常水平?？赡苁怯捎谀婢趁{迫下機體產(chǎn)生氧自由基含量增加，且細胞膜被破壞，導(dǎo)致酶蛋白外泄，相對SOD活力降低。

圖4 B. subtilis Q7對SOD酶活力的影響

2.3.4B.subtilisQ7對蘋果鏈格孢霉POD的影響

如圖5所示，處理組的POD酶活力在前6 h迅速提高，說明在逆境脅迫下，機體產(chǎn)生的過氧化物含量升高，從而導(dǎo)致機體POD分泌水平提高。隨著時間的延長，細胞膜損傷程度增加，通透性增大，導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白酶的外泄，細胞內(nèi)POD活力降低，24 h后POD活力趨于穩(wěn)定，但其活性僅為對照組的一半。

圖5 B. subtilis Q7對POD酶活力的影響

2.3.5B.subtilisQ7對蘋果鏈格孢霉PPO的影響

如圖6所示，處理組的PPO酶活力迅速降低，在9 h左右，PPO酶活力出現(xiàn)短暫且小幅恢復(fù)，但仍遠低于正常酶活水平，說明鏈格孢霉在逆境脅迫下，機體做出應(yīng)答反應(yīng)，但其抗逆性較差。12 h后趨于穩(wěn)定，其活力僅為正常酶活的1/3。

圖6 B. subtilis Q7對PPO酶活力的影響

B.subtilisQ7代謝產(chǎn)物對胞內(nèi)代謝酶活的影響可能有兩方面的原因：一是由于B.subtilisQ7代謝產(chǎn)物對蘋果鏈格孢霉細胞膜的破壞，加劇膜脂過氧化程度，使細胞膜的通透性增加，導(dǎo)致胞內(nèi)酶的外泄；另一方面，B.subtilisQ7代謝產(chǎn)物干擾或抑制酶的合成途徑，從而導(dǎo)致整體酶活的降低。

3 結(jié) 論

銀杏內(nèi)生菌芽孢桿菌B.subtilisQ7發(fā)酵液對蘋果鏈格孢霉具有明顯的抑制作用。實驗發(fā)現(xiàn)，B.subtilisQ7代謝產(chǎn)物提高了蘋果鏈格孢霉細胞膜透性，加劇細胞膜脂質(zhì)過氧化，影響其體內(nèi)代謝酶SOD、POD以及PPO的酶活力。B.subtilisQ7 代謝產(chǎn)物所表現(xiàn)的抑菌性質(zhì)可能與宿主銀杏的活性成分(如黃酮、多糖等)相關(guān)，今后將繼續(xù)深入研究B.subtilisQ7發(fā)酵液中對鏈格孢霉起抑制性作用的主要活性物質(zhì)的類別及生理生化特性，完善銀杏內(nèi)生細菌拮抗作用機制的理論基礎(chǔ)。