徐 志 超， 王 璐， 李 靜， 孫 銘 琦， 葉 淑 紅

( 大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

鏈格孢霉菌能侵染蘋果葉片引起葉片黑斑病和落葉病，同時(shí)在蘋果植株中定殖，在花期侵染花朵從而導(dǎo)致后期果實(shí)患霉心病[1]?；加忻剐牟〉奶O果在貯藏過程中易出現(xiàn)霉變腐爛現(xiàn)象，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前常用的蘋果霉心病的防治措施主要包括物理套袋和使用化學(xué)制劑，但物理套袋方法處理不當(dāng)會導(dǎo)致雨季果實(shí)腐爛，而化學(xué)藥劑防治存在農(nóng)殘的弊端，故生物防治無毒害等優(yōu)勢越來越引起人們的關(guān)注。

內(nèi)生菌是從植物組織中分離出的內(nèi)生細(xì)菌或真菌，能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的生理活性成分[3]。研究表明，多數(shù)植物內(nèi)生菌具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤等生理功能[4-5]，考慮篩選具有抑菌效果的植物內(nèi)生菌作為生防菌株，應(yīng)用于蘋果霉心病的防治。銀杏是一種藥食同源的植物，其提取物中的化學(xué)成分有200多種，主要包括黃酮類、萜內(nèi)酯類、有機(jī)酸類等生物活性成分[6]。王祖華等[9]篩選的銀杏內(nèi)生細(xì)菌拮抗菌株次級代謝產(chǎn)物對灰霉菌具有明顯的抑制作用。對銀杏內(nèi)生真菌的拮抗作用已有研究，但對內(nèi)生細(xì)菌的研究還不夠深入。課題組前期從不同區(qū)域銀杏分離得到銀杏內(nèi)生細(xì)菌，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其具有廣譜的抑菌能力[8]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究銀杏內(nèi)生菌對蘋果鏈格孢霉的抑制作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏內(nèi)生細(xì)菌、蘋果鏈格孢霉菌，實(shí)驗(yàn)室前期分離保存；肉湯培養(yǎng)基，PDA、PD培養(yǎng)基；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)/丙二醛(MOA)試劑盒，南京建成生物工程研究所有限公司。

PHS-3C pH計(jì)，TGL-16M高速冷凍離心機(jī)，DDS-307A電導(dǎo)率儀，Thermo酶標(biāo)儀。

1.2 方 法

1.2.1 目標(biāo)菌株的篩選

選取實(shí)驗(yàn)室保藏的10株銀杏內(nèi)生菌，活化制備菌液(106～108CFU/mL)，接種于肉湯培養(yǎng)液體發(fā)酵，取發(fā)酵上清液涂布于PDA平板；接種培養(yǎng)5 d的蘋果鏈格孢霉菌菌餅(直徑6 mm)于30 ℃培養(yǎng)3 d，用十字交叉法測定鏈格孢霉菌落直徑[9]。

1.2.2 目標(biāo)菌株的形態(tài)及生理生化鑒定

分別通過淀粉水解實(shí)驗(yàn)、油脂水解實(shí)驗(yàn)、石蕊牛乳實(shí)驗(yàn)檢測生理生化指標(biāo)[10-11]。

1.2.3 發(fā)酵液的制備

目標(biāo)菌株Q7活化培養(yǎng)12 h后，以2%接種量接入肉湯培養(yǎng)基，28 ℃、120 r/min培養(yǎng)3 d。發(fā)酵液于8 000 r/min低溫離心15 min，取上清液于0.22 μm濾膜過濾，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 菌株Q7對蘋果鏈格孢霉的抑制作用

1.2.4.1 對蘋果鏈格孢霉細(xì)胞膜通透性的影響

稱取5 g菌絲體接入100 mL PD培養(yǎng)液中，處理組為PD培養(yǎng)基中加入2 mL發(fā)酵液，對照組中加等量無菌水，于30 ℃、20 r/min培養(yǎng)，測定不同時(shí)間的電導(dǎo)率[12]。

1.2.4.2 對蘋果鏈格孢霉細(xì)胞膜丙二醛含量的影響

稱取1.5 g菌絲體接入100 mL PD培養(yǎng)基，30 ℃、120 r/min培養(yǎng)3 d，加入菌株Q7發(fā)酵液2 mL，加入等量無菌水作對照，于不同時(shí)間測定丙二醛含量[13]。

1.2.4.3 對蘋果鏈格孢霉細(xì)胞內(nèi)代謝酶的影響

發(fā)酵液制備同“1.2.4.1”，于不同時(shí)間取適量菌體用蒸餾水沖洗后，用濾紙吸干表面水分，準(zhǔn)確稱量濕菌體質(zhì)量，按質(zhì)量比1∶9加入生理鹽水，并加石英砂研磨，4 000 r/min 離心，上清液即為10%組織勻漿，加入等量無菌水作對照。使用試劑盒測定相關(guān)代謝的酶活力。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)菌株的篩選

考察10株銀杏內(nèi)生細(xì)菌的抑菌性，如表1所示。選定的內(nèi)生菌對蘋果鏈格孢霉均表現(xiàn)出較高的抑制效果，其中Q7的抑制效果最強(qiáng)，因此將Q7作為目標(biāo)菌株進(jìn)行生理生化鑒定并研究其對蘋果鏈格孢霉的抑制作用。

表1 10株內(nèi)生菌對蘋果鏈格孢霉的抑制作用

2.2 目標(biāo)菌形態(tài)及生理生化鑒定

鏡檢結(jié)果如圖1所示，Q7革蘭氏染色呈陰性，菌體形態(tài)呈桿狀。平板培養(yǎng)菌落形態(tài)呈規(guī)則圓點(diǎn)，表面光滑，較透明。

生理生化結(jié)果表明，Q7對淀粉和油脂的水解能力弱，石蕊牛乳顏色變暗，發(fā)酵液呈偏堿性。初步鑒定銀杏內(nèi)生菌Q7屬于芽孢桿菌屬B.subtilis。

圖1 菌體B. subtilis Q7的鏡檢結(jié)果

2.3 B. subtilis Q7對蘋果鏈格孢霉的抑制性

2.3.1B.subtilisQ7對蘋果鏈格孢霉細(xì)胞膜通透性的影響

生物細(xì)胞膜是一種具有選擇性的半透膜，有些抗菌物質(zhì)能夠破壞細(xì)胞膜的通透性，從而干擾細(xì)胞正常的物質(zhì)運(yùn)輸[12]。

由圖2可知，處理組電導(dǎo)率遠(yuǎn)高于對照組，說明B.subtilisQ7對鏈格孢霉細(xì)胞膜的破壞較嚴(yán)重。處理組前2 h電導(dǎo)率迅速升高，說明鏈格孢霉細(xì)胞膜遭到嚴(yán)重破壞，胞內(nèi)電解質(zhì)外泄，培養(yǎng)液電導(dǎo)率升高[14]。隨后鏈格孢霉出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，修護(hù)被破壞的細(xì)胞，表現(xiàn)在4 h后電導(dǎo)率略有降低，隨著時(shí)間的延長電導(dǎo)率略有升高至基本趨于穩(wěn)定。

圖2 B. subtilis Q7對細(xì)胞膜通透性的影響

2.3.2B.subtilis. Q7對蘋果鏈格孢霉脂質(zhì)過氧化的影響

丙二醛(MDA)是細(xì)胞遭受逆境傷害時(shí)膜脂過氧化程度大小的主要指標(biāo)之一[15]。處理組菌絲體中MDA含量明顯提高。如圖3所示，在9 h達(dá)到峰值，比對照組高50%，說明此時(shí)處理組菌絲體膜脂過氧化程度最嚴(yán)重，MDA積累量達(dá)到最大。9 h后，處理組MDA含量降低，說明蘋果鏈格孢霉對逆境脅迫的抵御作用減弱，細(xì)胞活性降低，在24 h后基本處于穩(wěn)定狀態(tài)。

圖3 B. subtilis Q7對細(xì)胞膜MDA質(zhì)量摩爾濃度的影響

2.3.3B.subtilisQ7對蘋果鏈格孢霉SOD的影響

如圖4所示，前3 h處理組SOD酶活力變化與對照組變化趨勢基本相同，3 h后處理組SOD活力顯著提高，這表明鏈格孢霉在逆境脅迫下，機(jī)體做出應(yīng)答反應(yīng)，通過協(xié)調(diào)酶的活性來保護(hù)細(xì)胞不受外界環(huán)境的影響[13]。隨著時(shí)間的延長，SOD活力開始減低，在20 h低于正常水平?？赡苁怯捎谀婢趁{迫下機(jī)體產(chǎn)生氧自由基含量增加，且細(xì)胞膜被破壞，導(dǎo)致酶蛋白外泄，相對SOD活力降低。

圖4 B. subtilis Q7對SOD酶活力的影響

2.3.4B.subtilisQ7對蘋果鏈格孢霉POD的影響

如圖5所示，處理組的POD酶活力在前6 h迅速提高，說明在逆境脅迫下，機(jī)體產(chǎn)生的過氧化物含量升高，從而導(dǎo)致機(jī)體POD分泌水平提高。隨著時(shí)間的延長，細(xì)胞膜損傷程度增加，通透性增大，導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白酶的外泄，細(xì)胞內(nèi)POD活力降低，24 h后POD活力趨于穩(wěn)定，但其活性僅為對照組的一半。

圖5 B. subtilis Q7對POD酶活力的影響

2.3.5B.subtilisQ7對蘋果鏈格孢霉PPO的影響

如圖6所示，處理組的PPO酶活力迅速降低，在9 h左右，PPO酶活力出現(xiàn)短暫且小幅恢復(fù)，但仍遠(yuǎn)低于正常酶活水平，說明鏈格孢霉在逆境脅迫下，機(jī)體做出應(yīng)答反應(yīng)，但其抗逆性較差。12 h后趨于穩(wěn)定，其活力僅為正常酶活的1/3。

圖6 B. subtilis Q7對PPO酶活力的影響

B.subtilisQ7代謝產(chǎn)物對胞內(nèi)代謝酶活的影響可能有兩方面的原因：一是由于B.subtilisQ7代謝產(chǎn)物對蘋果鏈格孢霉細(xì)胞膜的破壞，加劇膜脂過氧化程度，使細(xì)胞膜的通透性增加，導(dǎo)致胞內(nèi)酶的外泄；另一方面，B.subtilisQ7代謝產(chǎn)物干擾或抑制酶的合成途徑，從而導(dǎo)致整體酶活的降低。

3 結(jié) 論

銀杏內(nèi)生菌芽孢桿菌B.subtilisQ7發(fā)酵液對蘋果鏈格孢霉具有明顯的抑制作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，B.subtilisQ7代謝產(chǎn)物提高了蘋果鏈格孢霉細(xì)胞膜透性，加劇細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，影響其體內(nèi)代謝酶SOD、POD以及PPO的酶活力。B.subtilisQ7 代謝產(chǎn)物所表現(xiàn)的抑菌性質(zhì)可能與宿主銀杏的活性成分(如黃酮、多糖等)相關(guān)，今后將繼續(xù)深入研究B.subtilisQ7發(fā)酵液中對鏈格孢霉起抑制性作用的主要活性物質(zhì)的類別及生理生化特性，完善銀杏內(nèi)生細(xì)菌拮抗作用機(jī)制的理論基礎(chǔ)。