王玉婷，普布次仁*，麻文俊，劉 瑩，單增羅布

(1 西藏自治區(qū)林木科學(xué)研究院，拉薩 850000；2 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，國家林業(yè)局林木培育重點實驗室，北京 100091)

砂生槐(Sophoramoorcroftiana)是豆科(Leguminosae)槐屬(Sophora)落葉矮灌木，又名“西藏狼牙刺”，西藏高原特有種，主要分布于雅魯藏布江流域海拔2 800～4 500 m的山坡、河谷沙灘等地，是該流域干旱、半干旱河谷的主要建群、先鋒灌叢植物[1-2]。砂生槐結(jié)實量大、種子中含有大量可入藏藥成分的生物堿，因此具有一定的開發(fā)價值。

生物堿是植物次生代謝產(chǎn)生的特殊含氮堿性有機化合物，大多數(shù)有復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不溶或難溶于水，多具苦味[3-4]?？鄥㈩惿飰A廣泛存在于豆科槐屬植物中，主要包括苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、槐定堿、槐醇堿等。近些年廣泛使用苦參類生物堿過程中，發(fā)現(xiàn)了其多方面的藥理活性和臨床功能，具有抗癌、抗腫瘤、抗炎、抗心律失常等方面的作用[5-7]。早在1986年，崔建芳等研究發(fā)現(xiàn)，砂生槐種子含有氧化苦參堿、氧化槐果堿和苦參堿，并具有一定的藥效作用[8]，但未涉及群體遺傳方面的研究，針對不同群體砂生槐種子生物堿含量的研究還較少。為此，本研究進行了地理因子對不同群體砂生槐種子生物堿含量的影響探究，以及群體內(nèi)和群體間的遺傳變異模式分析，為探究砂生槐群體遺傳分化關(guān)系及進一步開發(fā)利用砂生槐藥物提供參考。

1 材料和方法

1.1 種源和取樣

2017年8～10月在西藏砂生槐分布區(qū)進行野外植株種子收集，以一江(雅魯藏布江)四河(年楚河、雅礱河、拉薩河和尼洋河)為主線，采種范圍覆蓋砂生槐的全部典型分布區(qū)域，最低海拔為東部邊緣的林芝縣米瑞鄉(xiāng)群體(海拔2 955 m)，最高海拔為日喀則市拉孜縣查務(wù)鄉(xiāng)群體(海拔4 117 m)。綜合考慮海拔和生境差異，最終確定10個群體進行采種，每個群體采集30個單株，每個單株距離50 m以上，共300株種子，測定苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿和槐定堿的含量。群體編號和地理位置見表1。

1.2 生物堿含量測定

采用Waters 2695 高效液相色譜儀將砂生槐種子樣品中各種生物堿分離并測定含量。參照張愛華等同時分離測定5種生物堿時的色譜條件，色譜柱：Waters XTerraTMRP C18(3.9 mm × 150 mm, 5 μm); 流動相：0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH8.5)-甲醇(78∶22)，流速為1 mL·min-1，檢測波長為220 nm[9]。色譜峰用峰面積法得到的堿含量記為CX(μg/mL)，實際測得生物堿含量計算公式為：

式中：C為實際檢測出的生物堿含量，CX為經(jīng)過校正后的堿含量測試原始值，V為測試種子體積，M為測試種子質(zhì)量。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件包和Excel進行統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析、方差分析、多重比較和相關(guān)性分析[10]。

表1 西藏砂生槐10個群體采樣地基本信息

2 結(jié)果與分析

2.1 生物堿含量比較

采集的10個西藏砂生槐群體天然種子中均檢測出含有氧化苦參堿、苦參堿和槐果堿(表2)，未檢測出槐定堿。其中，氧化苦參堿的含量占3種生物堿含量的90%以上，而其他2種生物堿含量較少，故稱為微量生物堿。不同群體氧化苦參堿含量變幅為46.18～64.08 mg/g，苦參堿含量變幅為1.14～9.82 mg/g，槐果堿含量變幅為0.08～1.16 mg/g。群體間氧化苦參堿、苦參堿和槐果堿均存在極顯著差異(P<0.01)。同時，氧化苦參堿含量以群體4最高，群體2最低；苦參堿和槐果堿含量均為群體3最高，群體5最低。

2.2 砂生槐群體間和群體內(nèi)變異分析

變異系數(shù)可在一定程度上揭示群體的遺傳變異[11]。從生物堿含量的變異系數(shù)(表3)看，氧化苦參堿含量在群體內(nèi)和群體間變異相對較小，苦參堿和槐果堿含量在群體內(nèi)和群體間變異系數(shù)均較大，并以7號群體的槐果堿含量變異系數(shù)最大(119.92%)，說明2個微量生物堿遺傳變異大，差異明顯。從群體間變異系數(shù)和群體內(nèi)變異系數(shù)看，氧化苦參堿和槐果堿的群體內(nèi)變異大于群體間變異(13.17%>10.37%, 64.79%>63.49%)，苦參堿的群體間變異大于群體內(nèi)變異(51.94%<68.00%)。

2.3 生長地理環(huán)境對生物堿的影響

相關(guān)分析結(jié)果表明(表4)，砂生槐種子中的生物堿含量與海拔、經(jīng)度和緯度呈不同的相關(guān)關(guān)系。氧化苦參堿與海拔呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與經(jīng)度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與緯度呈正相關(guān)關(guān)系；苦參堿與海拔、經(jīng)度和緯度均呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；槐果堿與海拔呈正相關(guān)關(guān)系，與經(jīng)度和緯度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。氧化苦參堿和槐果堿均隨著生長海拔的升高含量增高，而苦參堿含量減少；3種堿含量均隨經(jīng)度的增加而減?。豢鄥A和槐果堿隨緯度的升高而減小，而氧化苦參堿增高?？傮w上，高海拔、低經(jīng)緯度的群體3種生物堿含量較高。

表2 西藏砂生槐10個群體的生物堿含量

注：* 表示差異性顯著(P≤0.05)；** 表示差異極顯著(P≤0.01)。下同

Note: * indicates significant difference (P≤0.05); ** indicate extremely significant difference (P≤0.01). The same as below

從生物堿含量間的相關(guān)分析(表5)可知，氧化苦參堿與苦參堿和槐果堿呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，而苦參堿與槐果堿呈顯著正相關(guān)關(guān)系。說明主要堿和微量堿的占比總和一定，此增彼減，而2個微量堿占比大致相同，同增同減。

表3 西藏砂生槐各群體生物堿含量的變異系數(shù)

表4 西藏砂生槐地理因子與生物堿含量的相關(guān)系數(shù)

2.4 聚類分析

為了研究砂生槐群體間的相似性，基于3種生物堿含量對10個群體進行聚類分析(圖1)，當(dāng)歐氏距離為10時，10個群體被聚為4類，各類間的距離較大，說明各類差異比較大，相關(guān)性較小。第一類共包含3個群體，分別是群體5(曲水縣才納鄉(xiāng))、群體7(貢嘎縣崗堆鎮(zhèn))和群體8(山南地區(qū)澤當(dāng)鎮(zhèn))，由于群體5是雅魯藏布江分支拉薩河下游，群體7和群體8均為分支后雅魯藏布江的下游，且采種地理位置很近，說明這3個群體的原始群很可能在雅魯藏布江上游；第二類共包含3個群體，分別是群體9(工布江達縣)、群體10(林芝縣米瑞鄉(xiāng))和群體6(山南地區(qū)乃東縣)，群體9和群體10均在尼洋河流域，可能是水流原因?qū)⒎N子進行傳播，而群體6的聚類，屬于特別現(xiàn)象，有待進一步探究；第三類共包含2個群體，分別是群體1(拉孜縣查務(wù)鄉(xiāng))和群體4(墨竹工卡縣工卡鎮(zhèn))；第四類共包含2個群體，分別是群體2(江孜縣)和群體3(日喀則市尼倉村)，由于群體3采種點為雅魯藏布江與分支年楚河的交匯處，而群體2采種點江孜縣位于年楚河上游，說明群體2和群體3很可能是一個原始群，遺傳背景可能比較相似。

表5 西藏砂生槐3種主要生物堿的相關(guān)矩陣

圖1 西藏砂生槐10個群體的聚類分析Fig.1 Cluster analysis of 10 S. moorcroftiana populations in Tibet

經(jīng)聚類分析后，正常情況下將比較近的群體都聚在了一起，但是目前出現(xiàn)了將距離很遠的群體聚在一起，這可能是由于雖然距離遠，但是3種生物堿的含量分配比例或模式較為一致所致。

綜合生物堿含量與聚類分析結(jié)果，認(rèn)為在砂生槐種子生物堿開發(fā)上，群體1、3、4為“一江四河”流域的優(yōu)良群體。

3 討 論

3.1 砂生槐生物堿含量

生物堿的開發(fā)利用在煙草上較為廣泛且成熟，隨著現(xiàn)代相關(guān)研究的深入，農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥界也發(fā)現(xiàn)了生物堿帶來的優(yōu)良功效，而進行了大量深入挖掘和提取[5,12-13]。生物堿的含量和種類在一定程度上反映了生物的遺傳變異及遺傳多樣性，諸燕等[14]對不同種質(zhì)和年齡的鐵皮石斛總生物堿含量進行了研究，結(jié)果表明不同年限和地域的鐵皮石斛總生物堿含量差異很大。砂生槐種子中含有大量氧化苦參堿和少量苦參堿及槐果堿，3種生物堿總含量以拉孜縣群體含量最高(69.32 mg/g)，工布江達縣群體含量最低(54.28 mg/g)。10個砂生槐群體種子生物堿含量在群體內(nèi)和群體間的變異系數(shù)均存在極顯著的差異，達到10%以上，說明砂生槐種子生物堿含量存在較為豐富的遺傳變異，從而為高生物堿含量群體或個體的篩選奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.2 不同群體砂生槐相關(guān)性分析

砂生槐種子生物堿的含量與地理因子也存在一定相關(guān)性，生物堿含量隨海拔而變化的原因，可能是海拔變化，光照強度不同；同時，海拔變化導(dǎo)致的晝夜溫差及太陽輻射量的改變也可能對生物堿合成起到了一定的促進或抑制作用，最終導(dǎo)致生物堿含量隨生長海拔而變化。海拔高度對不同生物堿的影響程度不同，可能是對生態(tài)因子的敏感程度不同。這與簡永興等[15]研究烤煙種植海拔對生物堿影響的規(guī)律恰好相反，可能是因為植物生理特性、地理位置、環(huán)境和氣候不同，導(dǎo)致本研究中影響規(guī)律不明顯，相關(guān)系數(shù)絕對值較小。

綜上所述，由于砂生槐自然分布區(qū)的海拔、經(jīng)緯度跨度大，覆蓋的河流多，自然環(huán)境多樣，經(jīng)過長期的自然生長和選擇，種子內(nèi)生物堿含量發(fā)生了顯著的群體內(nèi)和群體間變異，進而導(dǎo)致豐富的遺傳變異。因此，砂生槐種子內(nèi)生物堿含量的探究對選育優(yōu)良群體、優(yōu)良種質(zhì)資源保存、開發(fā)利用及遺傳改良具有極為重要的意義，期望能夠?qū)⑽鞑靥赜朽l(xiāng)土樹種推廣到各個行業(yè)進行具有民生意義的利用。