張 寧，敖 妍，2*，蘇淑釵，2，劉覺(jué)非，黃曜曜，劉金鳳，張行杰

(1 北京林業(yè)大學(xué) 省部共建森林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2 國(guó)家能源非糧生物質(zhì)原料研發(fā)中心，北京 100083；3 赤峰市林業(yè)種苗站，內(nèi)蒙古赤峰 024000；4 勝利油田勝大生態(tài)林場(chǎng)，山東東營(yíng) 257000)

文冠果(XanthocerassorbifoliumBunge)隸屬無(wú)患子科(Sapindaceae)文冠果屬(XanthocerasBunge)，落葉小喬木或灌木，雌雄同株，具有耐寒、耐旱、耐瘠薄等特性，主要分布于中國(guó)北方地區(qū)[1]。其綜合利用價(jià)值較高，在食品、化工、醫(yī)藥方面都已經(jīng)開(kāi)發(fā)利用，并具有較高的生態(tài)價(jià)值和觀賞價(jià)值。文冠果結(jié)實(shí)早，結(jié)果期長(zhǎng)，種仁油脂含量可達(dá)67%[2]，種子油是很好的食用油，也可用作制備生物柴油。該樹(shù)種已被國(guó)家林業(yè)局列為重要生物質(zhì)能源樹(shù)種，并于2014年發(fā)布了其原料林可持續(xù)培育指南。但生產(chǎn)中文冠果繁花少實(shí)，種子產(chǎn)量低，這是目前亟待解決的問(wèn)題。文冠果為總狀花序，頂芽花序上多著生雌能花，側(cè)芽花序上多為雄能花，因而雌能花數(shù)量遠(yuǎn)少于雄能花[3]。研究雌能花和雄能花發(fā)育過(guò)程，確定性別分化時(shí)期是進(jìn)行性別調(diào)控的基礎(chǔ)，對(duì)促進(jìn)雌能花分化，提高雌雄比例，進(jìn)而大幅提高種子產(chǎn)量具有重要理論和實(shí)踐意義。

植物性別分化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，氣象條件、地理種源、栽培地點(diǎn)都可能影響該過(guò)程[4-9]。研究表明，氣象因子尤其是溫度能影響植物體內(nèi)碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累及激素分配，例如，高溫會(huì)造成營(yíng)養(yǎng)大量消耗，直接影響開(kāi)花質(zhì)量和花性別[10-14]。另外，植物生長(zhǎng)期或某個(gè)發(fā)育期一般需要具有特定閾值的活動(dòng)積溫[15-16]，溫度會(huì)影響花芽分化的速率和進(jìn)程，并影響花性別[17-19]。對(duì)于某些植物，例如胡麻、黃瓜等，適度低溫利于雌花分化[11，20]。此外，濕度對(duì)植物的花芽分化和性別分化進(jìn)程也有重要影響。適度的水分脅迫促進(jìn)植物對(duì)碳水化合物的積累，有利于花芽分化；相反，較大空氣濕度和低溫以及光照程度不足等均會(huì)對(duì)花芽分化及開(kāi)花產(chǎn)生影響[21-24]。土壤和空氣相對(duì)濕度對(duì)雌雄花的比例有很大影響[25-30]。一定范圍內(nèi)，土壤持水量和空氣濕度越大，越有利于雌花分化[11]。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)文冠果花芽發(fā)育的研究主要集中于分化過(guò)程觀察[31-32]、雌雄蕊選擇性敗育[33-36]等，明確了文冠果花芽分化過(guò)程，以及雌雄蕊敗育發(fā)生時(shí)期。但以往研究多是針對(duì)某地區(qū)某年份的研究，由于時(shí)間和空間限制，難以將其結(jié)論應(yīng)用到其他地區(qū)或同一地區(qū)的其他年份。而且，對(duì)文冠果性別分化出現(xiàn)的時(shí)期及持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短與氣象因素關(guān)系的研究報(bào)道甚少。文冠果花芽分化和性別分化是生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵階段，是復(fù)雜的形態(tài)建成過(guò)程。其分化結(jié)果直接影響種實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)的提高。研究分化過(guò)程關(guān)鍵期的內(nèi)外形態(tài)特征及與氣象條件的關(guān)系，對(duì)人為調(diào)控雌雄比例、提高種實(shí)產(chǎn)量有著重要作用。為此，本研究將雌能花和雄能花性別分化過(guò)程外部形態(tài)特點(diǎn)與內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)，同時(shí)監(jiān)測(cè)溫度、濕度、降水等氣象因子，明確了文冠果性別分化的關(guān)鍵期，掌握了該過(guò)程內(nèi)外部形態(tài)特征的相關(guān)性，同時(shí)闡述了性別分化各階段與氣象因子的對(duì)應(yīng)關(guān)系。研究結(jié)論可為不同地區(qū)文冠果依據(jù)花芽外部形態(tài)和氣象數(shù)據(jù)推測(cè)內(nèi)部分化進(jìn)程、判斷性別分化關(guān)鍵期提供參考，為適時(shí)采用栽培管理措施調(diào)控性別分化提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于山東省東營(yíng)市東營(yíng)區(qū)勝大林場(chǎng)，地處E118°12′42″～118°59′52″，N37°14′13″～37°31′57″，海拔8.8 m。屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年降水量550～600 mm，多集中在夏季。年平均氣溫約12.5 ℃， 1月均溫0.06 ℃，7月均溫28.31 ℃，≥10 ℃積溫約4 300 ℃，無(wú)霜期長(zhǎng)達(dá)206 d。

1.2 試驗(yàn)材料

樣地內(nèi)文冠果為當(dāng)?shù)仄鹪吹?年實(shí)生人工林。平均樹(shù)高2.8 m，平均胸徑13 cm，株行距3.0 m×3.0 m，樹(shù)冠體積在4.5～5.0 m3之間[37]。選擇林分內(nèi)具有代表性的生長(zhǎng)健壯、樹(shù)勢(shì)一致、無(wú)病蟲(chóng)害的文冠果植株10株作為觀察和采樣對(duì)象。

1.3 試驗(yàn)方法

(1)雌、雄能花分布觀測(cè)：在每株樣樹(shù)東西南北方向各選擇3個(gè)枝條，共120個(gè)枝條，掛牌標(biāo)記，花開(kāi)放后統(tǒng)計(jì)頂、側(cè)花序上雌、雄能花數(shù)量。計(jì)算各自在頂側(cè)花序上所占比例。

(2)性別分化觀測(cè)：參考前人研究結(jié)果[32]，于2017年2月21日至4月30日期間取樣。其中，2月21日至3月31日，取頂、側(cè)芽(花序)，每5 d取樣1次；4月1日至4月30日，取頂、側(cè)花序上的單花，每3 d取樣1次，直到雄能花散粉、雌能花可授時(shí)，共取樣18次。分化初期花序未伸長(zhǎng)時(shí)，每次采集樣株樹(shù)冠南向外圍枝條的頂、側(cè)芽，側(cè)芽采集枝條形態(tài)學(xué)下端第3～5個(gè)花序。花序伸長(zhǎng)后，為保持一致性，采集頂、側(cè)花序形態(tài)學(xué)下端第6～7個(gè)花蕾。每次每棵樹(shù)頂、側(cè)花芽(蕾)各取5個(gè)，共50個(gè)芽。樣品分別用于外部形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)觀察。

(3)形態(tài)學(xué)觀察：對(duì)選取的頂、側(cè)芽觀察其外部形態(tài)特點(diǎn)，記錄形狀、顏色，用電子游標(biāo)卡尺(上海首豐精密儀器有限公司)測(cè)量橫、縱徑，并拍照。

(4)解剖學(xué)觀察：樣品用FAA固定液固定，帶回實(shí)驗(yàn)室，常規(guī)石蠟切片制作，番紅-固綠染色，加拿大樹(shù)膠封片，Olympus CX-41 光學(xué)顯微鏡觀察并拍照記錄[38]。

(5)氣象因子觀測(cè)：2017年2月21日至4月30日期間，進(jìn)行形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)觀察的同時(shí)進(jìn)行氣象因子觀測(cè)，主要監(jiān)測(cè)樣地的溫、濕度數(shù)據(jù)。在試驗(yàn)地中部放置ARN-17溫濕度自動(dòng)記錄儀(河北奧爾諾電子科技有限公司)，記錄地表以上20 cm處空氣溫、濕度，數(shù)據(jù)每隔1 h記錄存儲(chǔ)1次。降水?dāng)?shù)據(jù)由氣象站獲得，試驗(yàn)地?zé)o灌溉。

1.4 數(shù)據(jù)處理

文冠果生物學(xué)零度根據(jù)芽膨大前10 d平均氣溫公式法計(jì)算[39]。

K=∑T/N

(1)

式中：K表示生物學(xué)零度；T表示芽膨大前10 d平均溫度(先計(jì)算每天平均溫度值，再計(jì)算10 d平均值所得)；N表示觀測(cè)年份。

日平均氣溫高于生物學(xué)零度時(shí)起計(jì)算各時(shí)期開(kāi)始時(shí)和各時(shí)期內(nèi)的有效積溫、平均溫度和平均濕度[40]。

≥K有效積溫∑T=∑(t-K)

(2)

≥5℃有效積溫∑T=∑(t-5)

(3)

≥10℃有效積溫∑T=∑(t-10)

(4)

式中：t表示日平均氣溫。(其中t-K、t-5、t-10均大于0，若小于等于0，以0計(jì)算)。

采用Excel 2013和SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 文冠果不同性別花的分布

表1為頂、側(cè)花序上雌、雄能花的比例差異?？梢?jiàn)，雌能花和雄能花的比例在頂、側(cè)花序上存在極顯著差異，頂花序上89.79%是雌能花，側(cè)花序上91.04%是雄能花。雄能花在頂花序上分布的變異系數(shù)較大，但在側(cè)花序上的變異系數(shù)僅為3.22%。雌能花在側(cè)花序上的分布比例變異系數(shù)較大，為32.7%，但在頂花序上分布比例的變異系數(shù)僅為8.15%?？傮w來(lái)看，頂花序上雌能花的分布和側(cè)花序上雄能花的分布是相對(duì)穩(wěn)定的。因此，雌能花和雄能花樣品分別采自頂花序和側(cè)花序。

2.2 文冠果花性別分化過(guò)程外部形態(tài)與內(nèi)部解剖特點(diǎn)

2.2.1性別分化早期外部形態(tài)與內(nèi)部結(jié)構(gòu)2月21日，文冠果花芽被褐色鱗片，側(cè)芽橫徑3.98～4.87 mm、縱徑3.32～4.12 mm，頂芽橫徑6.67～8.32 mm、縱徑5.46～6.21 mm(圖1，①)。內(nèi)部雄蕊呈棒狀體(圖1，①a)。3月3日～3月18日，花芽開(kāi)始萌動(dòng)，芽呈圓錐形膨大，芽鱗錯(cuò)開(kāi)，露出黃綠色伴有紅色的芽體，側(cè)芽橫徑4.33～6.63 mm、縱徑5.61～8.75 mm，頂芽橫徑5.21～7.92 mm、縱徑6.73～9.91 mm(圖1，②③)。內(nèi)部頂端生長(zhǎng)點(diǎn)明顯增大突起，雌蕊原基出現(xiàn)(圖1，②a)。雄蕊原基細(xì)胞分裂較快，雄蕊伸長(zhǎng)，頂端形成分生組織，出現(xiàn)幼嫩花藥，花絲伸長(zhǎng)，花粉囊出現(xiàn)(圖1，③a)。3月18日～3月23日，芽繼續(xù)膨大，鱗片淺綠色，芽體露出，頂部露出花蕾，側(cè)芽橫徑5.13～8.34 mm、縱徑9.36～12.35 mm，頂芽橫徑5.88～9.32 mm、縱徑10.56～13.22 mm(圖1，④⑤)。雌蕊繼續(xù)膨大?；ㄋ幊实危?室，左右基本對(duì)稱(chēng)(圖1，④a)，藥室內(nèi)處于造孢細(xì)胞時(shí)期，最內(nèi)一層細(xì)胞體積較大，胞質(zhì)濃厚(圖1，④b)。隨著周緣細(xì)胞的分裂，由外向內(nèi)逐漸分化出花藥壁，造孢細(xì)胞相應(yīng)分裂形成體積較大、細(xì)胞核明顯、細(xì)胞質(zhì)濃厚、無(wú)明顯液泡的花粉母細(xì)胞，即小孢子母細(xì)胞(圖1，⑤a)。同時(shí)花藥壁發(fā)育完全，由5層細(xì)胞組成，由外向內(nèi)依次為表皮細(xì)胞、纖維層細(xì)胞、2層中間層細(xì)胞、絨粘層細(xì)胞(圖1，⑤a)。

表1 文冠果不同性別花在頂側(cè)花序分布比例差異

注：**表示在0.01水平差異顯著。變異系數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)差/均值×100%

Note:** indicating the significant difference at 1% level. The coefficient of variation is the ratio of the standard deviation to the mean multiplied by 100%

3月23日～4月2日，花序迅速伸長(zhǎng)，鱗片脫落，露出綠色花蕾，側(cè)花序橫徑8.38～10.01 mm、縱徑13.03～21.17 mm，花蕾橫徑1.76～2.31 mm、縱徑1.72～2.10 mm。頂花序橫徑8.92～10.38 mm、縱徑15.76～20.03 mm，花蕾橫徑1.22～1.54 mm、縱徑1.23～1.45 mm(圖1，⑥⑦)。內(nèi)部花粉囊的中層和絨粘層逐漸解體(圖1，⑥a)，小孢子母細(xì)胞彼此分離，進(jìn)入減數(shù)分裂階段(圖1，⑥b)。隨后進(jìn)入小孢子四分體時(shí)期，其胞質(zhì)分裂方式為同時(shí)型分裂，四分體的4個(gè)子細(xì)胞呈四面體排列(圖1，⑦a)。出現(xiàn)子房、胚珠雛形(圖1，⑦b)，部分花出現(xiàn)實(shí)心子房(圖1，⑦c)，柱頭伸長(zhǎng)(圖1，⑦d)。

2.2.2性別分化后期雄能花的形成4月3日～4月9日，雄能花花蕾增大至露白，橫徑2.05～4.54 mm、縱徑2.99～5.32 mm(圖2，①②)。內(nèi)部子房和胚珠出現(xiàn)敗育跡象，子房壁細(xì)胞不規(guī)則扭曲變形(圖2，①a)，胚珠內(nèi)大孢子母細(xì)胞四分體出現(xiàn)異常(圖2，①b)。花藥絨粘層分泌胼胝質(zhì)酶，將花粉四分體的胼胝質(zhì)壁溶解，單核花粉粒從四分體釋放出來(lái)，花粉粒的核位于細(xì)胞中央，具有濃厚的細(xì)胞質(zhì)(圖2，②a)。4月9日～4月12日，雄能花逐漸開(kāi)放，橫徑6.89～8.42 mm、縱徑5.24～7.33 mm(圖2，③)。內(nèi)部花粉粒細(xì)胞體積迅速增大，細(xì)胞質(zhì)明顯液泡化，形成中央大液泡，將細(xì)胞核擠到一側(cè)，花粉發(fā)育進(jìn)入單核靠邊期(圖2，③a)。接著進(jìn)行一次有絲分裂，形成雙核花粉粒(圖2，③b)。4月12日～4月15日，花朵開(kāi)放，橫徑21.20～25.31 mm、縱徑14.57～17.65 mm，8枚雄蕊，雄蕊伸長(zhǎng)速度快于雌蕊，看不到子房(圖2，④⑤)?；ǚ哿＿M(jìn)一步增大，整個(gè)細(xì)胞從花粉粒壁部脫離，可見(jiàn)3個(gè)萌發(fā)孔，花粉粒成熟(圖2，④a)。子房完全敗育，只剩下細(xì)胞壁團(tuán)，胚珠停止發(fā)育并退化，柱頭嚴(yán)重萎縮(圖2，④b)；前期出現(xiàn)實(shí)心子房的花子房干癟，頂端萎縮，無(wú)花柱(圖2，⑤a)。

2.2.3性別分化后期雌能花的形成4月3日～4月9日，雌能花花蕾橫徑1.83～2.92 mm、縱徑2.01～3.12 mm(圖3，①)。內(nèi)部子房胚珠正常發(fā)育，柱頭繼續(xù)伸長(zhǎng)(圖3，①a)，胚珠為雙珠被，珠心內(nèi)部體積大、細(xì)胞質(zhì)濃厚的細(xì)胞為孢原細(xì)胞(圖3，①b)。4月9日～4月12日，花蕾露白，橫徑3.58～7.29 mm、縱徑3.86～7.69 mm(圖3，②)。此時(shí)大孢子母細(xì)胞經(jīng)兩次減數(shù)分裂，發(fā)育為大孢子四分體，其中3個(gè)大孢子逐漸退化消失，只有1個(gè)大孢子可以發(fā)育為胚囊(即功能大孢子)(圖3，②a)。4月12日～4月15日，花朵沿花序軸自下而上依次開(kāi)放，花橫徑12.25～18.30 mm、縱徑8.30～10.98 mm；子房橫徑2.02～2.72 mm、縱徑2.22～3.20 mm，花柱長(zhǎng)2.52～2.74 mm，花絲停止伸長(zhǎng)，柱頭高于雄蕊(圖3，③④)。花藥中單核花粉粒有絲分裂異常，液泡化衰敗，看不到明顯的細(xì)胞核(圖3，③a)。內(nèi)部功能大孢子發(fā)育，細(xì)胞體積逐漸增大，發(fā)育為單核胚囊(圖3，③b)。之后連續(xù)進(jìn)行3次有絲分裂，依次形成二核、四核、八核胚囊(圖3，④a、④b、④c)。至4月18日，柱頭發(fā)育為圓球形，子房膨大，花藥干癟(圖3，⑤)。子房胚珠形態(tài)發(fā)育完全(圖3，⑤a)，中空花柱道，柱頭開(kāi)裂，乳突狀細(xì)胞可見(jiàn)(圖3，⑤b)?；ㄋ幓ǚ勰覜](méi)有形成唇細(xì)胞，不開(kāi)裂(圖3，⑤c)，或花藥絨粘層解體不完全，僅留1層萎縮的細(xì)胞質(zhì)殘跡，花粉敗育，無(wú)萌發(fā)孔(圖3，⑤d)。

①.2月21日花芽；②.3月3日花芽；③.3月8日花芽；④.3月13日花芽；⑤.3月23日花芽；⑥.3月28日花序；⑦.4月2日花序。①a.雄蕊棒狀體；②a.雌蕊原基；③a.花藥形成、花絲伸長(zhǎng)；④a.雌蕊原基膨大、花粉囊形成；④b.造孢細(xì)胞時(shí)期；⑤a.小孢子母細(xì)胞、花藥壁形成；⑥a.中層絨粘層解體；⑥b.小孢子母細(xì)胞分離；⑦a.四分體時(shí)期；⑦b.胚珠原基出現(xiàn)；⑦c.實(shí)心子房；⑦d.柱頭伸長(zhǎng)。Sp.雄蕊原基；Pp.雌蕊原基；A.花藥； F.花絲；Sc.造孢細(xì)胞；MMc.小孢子母細(xì)胞；Ep.表皮；Fl.纖維層；Ml.中層；Ta.絨粘層；T.四面體型；Ova.子房；Ovu.胚珠；S.柱頭。圖①a、圖①b意為該時(shí)期對(duì)應(yīng)的外部形態(tài)為圖①，下同圖1 文冠果花性別分化早期外部形態(tài)與內(nèi)部結(jié)構(gòu)特點(diǎn)①. Flower buds on February 21; ②. Flower buds on March 3; ③. Flower buds on March 8; ④. Flower buds on March 13; ⑤. Flower buds on March 23; ⑥. Inflorescence on March 28; ⑦. Inflorescence on April 2. ①a. Stamens clavule; ②a. Pistil primordium; ③a. Anther formation stage and filament elongation stage; ④a. Pistil primordial enlargement and pollen sac formation stage; ④b. Spore cell stage; ⑤a. Microspore mother cells and anther wall formation stage; ⑥a. Middle cashmere layer disintegration; ⑥b. Microspore mother cell separation; ⑦a. Tetrad period; ⑦b. Ovule primordia appear; ⑦c. Solid child room; ⑦d. Stigma extension stage. Sp. Stamen primordium; Pp. Pistil primordium; A. Anther; F. Filaments; Sc. Sporogenous cells; MMc. Microspore mother cell; Ep. Epidermis; Fl. Fiber layer; Ml. Middle layer; Ta. Tapetum; T. Tetrahedral; Ova. Ovary; Ovu. Ovules; S. Stigma. Fig.①a and Fig.①b mean that the corresponding external appearance of this period is Fig.①, the same as belowFig.1 The external morphology and internal structural characteristics at the early stage of flower sex differentiation of X. sorbifolium

①.4月3日雄能花花蕾；②.4月6日雄能花；③.4月9日雄能花；④.4月12日雄能花；⑤.4月15日雄能花。①a.子房胚珠發(fā)生敗育；①b.大孢子母細(xì)胞四分體；②a.單核花粉粒；③a.單核花粉靠邊期；③b.雙核花粉粒；④a.成熟花粉粒；④b.敗育的子房胚珠；⑤a.萎縮的實(shí)心子房。S.柱頭；Ovu.胚珠；Mc.大孢子母細(xì)胞；Mp.單核花粉粒；Up.單核靠邊花粉；Vn.營(yíng)養(yǎng)核；Rn.生殖核；P.花粉；Gp.萌發(fā)孔；Pp.雌蕊原基圖2 文冠果性別分化后期雄能花形成過(guò)程中外部形態(tài)和內(nèi)部解剖特點(diǎn)①. Male flower bud on April 3; ②. Male flower on April 6; ③. Male flower on April 9; ④. Male flower on April 12; ⑤. Male flower on April 15.①a. The ovary and ovules abortion occurred; ①b. The tetrad stage of megaspore mother cell; ②a. Mononuclear pollen grains; ③a. Mononuclear pollen by the edge; ③b. Binuclear pollen grains; ④a. Mature pollen grains; ④b. Aborted ovary and ovules; ⑤a. Shrinking solid ovary. S. Stigma; Ovu. Ovules; Mc. Megaspore mother cell; Mp. Mononuclear pollen; Up. Uninucleate pollen; Vn. Vegetative nucleus; Rn. Reproductive nucleus; P. Pollen; Gp. Germ pore; Pp. Pistil primordiumFig.2 The external morphology and internal anatomical characteristics in the process of male flower formation at the late stage of sex differentiation of X. sorbifolium

①.4月3日雌能花花蕾；②.4月9日雌能花；③.4月12日雌能花；④.4月15日雌能花；⑤.4月18日雌能花。①a.柱頭伸長(zhǎng)；①b.胚珠和孢原細(xì)胞；②a.小孢子母細(xì)胞四分體時(shí)期；③a.單核花粉粒有絲分裂時(shí)期；③b.單核胚囊；④a.雙核胚囊；④b.四核胚囊；④c.八核胚囊；⑤a.胚珠；⑤b.花柱、柱頭和乳突狀細(xì)胞；⑤c.不開(kāi)裂的花藥；⑤d.花藥壁殘跡、敗育花粉。Ovu.胚珠；S.柱頭；Ac.孢原細(xì)胞；Iit.內(nèi)珠被；Oit.外珠被；Fm.功能大孢子；Tes.二核胚囊；Fes.四核胚囊；Mes.成熟胚囊；Pc：乳突狀細(xì)胞；P.花粉圖3 文冠果性別分化后期雌能花形成過(guò)程中外部形態(tài)和內(nèi)部解剖特點(diǎn)①. Female flower bud on April 3; ②. Female flower on April 9; ③. Female flower on April 12; ④. Female flower on April 15; ⑤. Female flower on April 18. ①a. Stigma extension stage; ①b. Ovules and sporogenous cells; ②a. The tetrad stage of microspore mother cell; ③a. The mitotic period of mononuclear pollen grains; ③b. Mononuclear embryo sac; ④a. Two-nucleus embryo sac; ④b. Four-nucleus embryo sac; ④c. Mature embryo sac; ⑤a. Ovules; ⑤b. Styles and mastoid cells on stigmas; ⑤c. Non-cracking anthers; ⑤d. Anther wall remnants and abortion pollen. Ovu. Ovules; S. Stigma; Ac. Archesporial cells; Iit. Inner integument; Oit. Outer integument; Fm. Functional megaspore; Tes. Two-nucleus embryo sac; Fes. Four-nucleus embryo sac; Mes. Matured embryo sac; Pc. Papillary cell; P. PollenFig.3 The external morphology and internal anatomical characteristics in the process of female flower formation at the late stage of sex differentiation of X. sorbifolium

2.3 文冠果花性別分化過(guò)程中氣象因子的變化

文冠果花芽在3月3日開(kāi)始萌動(dòng)，根據(jù)1.3.4公式(1)得出文冠果生物學(xué)零度K為4.4 ℃。從2月下旬氣溫開(kāi)始回升，至3月3日雌蕊原基開(kāi)始分化，期間平均氣溫達(dá)到4.4 ℃，可視為休眠期結(jié)束的溫度指標(biāo)?；ㄑ客獍l(fā)育各時(shí)期與該時(shí)期內(nèi)氣象因子的對(duì)應(yīng)關(guān)系見(jiàn)表2。結(jié)合內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果，得出文冠果花芽外發(fā)育各時(shí)期開(kāi)始時(shí)有效積溫變化和各時(shí)期對(duì)應(yīng)的平均溫度變化趨勢(shì)見(jiàn)圖4。各時(shí)期對(duì)應(yīng)的降水量、平均濕度變化趨勢(shì)見(jiàn)圖5。

表2 文冠果花性別分化時(shí)期與各時(shí)期內(nèi)的氣象因子

雄蕊原基分化期(2月21日～3月2日)； 雌蕊原基分化期(3月3日～3月7日)； 花藥形成期、造孢細(xì)胞時(shí)期(3月3日～3月17日)； 花藥壁分化完全、小孢子母細(xì)胞時(shí)期(3月18日～3月22日)； 小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期；子房胚珠雛形期(3月23日～4月2日)； 雄能花小孢子母細(xì)胞四分體時(shí)期、單核花粉粒時(shí)期、子房胚珠敗育期(4月3日～4月8日)； 雌能花柱頭伸長(zhǎng)期、大孢子母細(xì)胞時(shí)期(4月3日～4月8日)； 雄能花雙核花粉粒形成期(4月9日～4月12日)； 雌能花大孢子母細(xì)胞四分體時(shí)期、花粉敗育期(4月9日～4月12日)； 雄能花花粉粒成熟期、子房胚珠完全敗育(4月13日～4月15日)； 雌能花胚囊成熟期(4月13日～4月18日)圖4 文冠果花性別分化過(guò)程中有效積溫和平均溫度的變化 Stamen primordium differentiation (February 21st to March 2nd); Pistil primordial differentiation (March 3rd to March 7th); Anther formation stage and spore cell stage (March 3rd to March 7th); Anther wall formation and microspore mother cells stage (March 18th to March 22nd); Meiosis of microspore mother cells; The early stage of ovary and ovules (March 23 to April 2); The tetrad stage of microspore mother cell, mononuclear pollen stage and the abortion stage of ovary and ovules in male flowers (April 3 to April 8); Stigma extension stage and megaspore mother cell stage in female flowers (April 3 to April 8); Dual nuclear pollen formation period in male flowers (April 9th to April 12th); The tetrad stage of megaspore mother cell and pollen abortion period in female flowers (April 9th to April 12th); Mature period of pollen grains and complete abortion of ovary and ovule in male flowers (April 13th to April 15th); Embryonic sac maturity of female flowers (April 13th to April 18th).Fig.4 Changes of effective accumulated temperature and average temperature in the process of flower sex differentiation in X. sorbifolium Bunge

由圖4、圖5和表2可見(jiàn)，花芽膨大前10 d，出現(xiàn)一次7.3 mm的降水。3月3日，≥K有效積溫達(dá)到20.2 ℃時(shí)，雌蕊原基開(kāi)始分化。3月8日，≥K有效積溫達(dá)到25.5 ℃時(shí)，花藥開(kāi)始分化形成花粉囊，進(jìn)入造孢細(xì)胞時(shí)期，雄蕊細(xì)胞分裂旺盛，直至3月22日形成小孢子母細(xì)胞，此時(shí)期≥K有效積溫達(dá)到80 ℃，空氣平均溫度10.08 ℃。初春氣溫回升較慢，因而造孢細(xì)胞至小孢子母細(xì)胞形成時(shí)期持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，達(dá)15 d。期間降水為0，空氣相對(duì)濕度處于較低水平39.53%。3月23日，≥K有效積溫達(dá)到111.5 ℃是小孢子母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂時(shí)期的溫度指標(biāo)。小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期，空氣平均溫度10.05 ℃，此時(shí)期持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，達(dá)11 d。3月23日到4月2日，出現(xiàn)連續(xù)降水，累積達(dá)22.4 mm，空氣相對(duì)濕度達(dá)到58.22%，適度的降水促進(jìn)了內(nèi)部子房胚珠的出現(xiàn)。4月2日，當(dāng)≥K有效積溫達(dá)到166.5 ℃時(shí)出現(xiàn)子房胚珠雛形，隨即小孢子母細(xì)胞進(jìn)入四分體時(shí)期，形成單核花粉粒。

圖5 文冠果花性別分化過(guò)程中降水量和平均濕度的變化Fig.5 Changes of precipitation and average humidity in the process of flower sex differentiation in X. sorbifolium Bunge

接下來(lái)進(jìn)入雄能花雌蕊和雌能花雄蕊敗育時(shí)期。4月8日，當(dāng)≥K有效積溫達(dá)到230.6 ℃、≥5 ℃有效積溫達(dá)到207.5 ℃、≥10 ℃有效積溫為60 ℃時(shí)，雄能花胚珠內(nèi)大孢子四分體出現(xiàn)異常，子房壁和胚珠細(xì)胞出現(xiàn)萎縮敗育跡象；雌能花進(jìn)入大孢子母細(xì)胞時(shí)期。此時(shí)空氣平均溫度11.5 ℃，平均相對(duì)濕度67.83%。4月12日，當(dāng)≥K有效積溫達(dá)到264 ℃、≥5 ℃有效積溫達(dá)到238.5 ℃、≥10 ℃有效積溫為71.5 ℃時(shí)，雄能花進(jìn)入雙核花粉粒形成期；雌能花大孢子母細(xì)胞進(jìn)入四分體時(shí)期，花藥中單核花粉粒有絲分裂發(fā)生異常，液泡化衰敗。此時(shí)空氣平均溫度18 ℃，平均相對(duì)濕度38.75%，處于較低水平。4月3日到4月12日，是文冠果生殖器官發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，此期間降水量?jī)H為4 mm。4月13日到4月15日，出現(xiàn)較高降水量34 mm，適當(dāng)?shù)乃钟欣诖菩叟渥芋w的成熟。至4月15日，≥K有效積溫達(dá)到311.8 ℃，≥5 ℃有效積溫達(dá)到284.5 ℃，≥10℃有效積溫為102.5 ℃時(shí)，雄能花花粉粒成熟，但子房胚珠只剩細(xì)胞殘跡。雄配子體成熟時(shí)期，空氣平均溫度達(dá)到20.33 ℃，平均相對(duì)濕度45.5%，持續(xù)時(shí)間僅3 d。4月18日，雌能花胚囊成熟，但花粉敗育或花藥不開(kāi)裂。此時(shí)≥K有效積溫達(dá)到353.1 ℃，≥5℃有效積溫達(dá)到324 ℃，≥10 ℃有效積溫為127 ℃。雌配子體成熟時(shí)期，空氣平均溫度19.25 ℃，平均相對(duì)濕度48.8%，持續(xù)時(shí)間6 d。

3 討 論

明確花芽發(fā)育過(guò)程及與外部形態(tài)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，可為采取合理的栽培管理措施提供重要的參考依據(jù)。薄殼山核桃、板栗、山雞椒等都有關(guān)于雌雄花芽發(fā)育進(jìn)程外部形態(tài)的變化與內(nèi)部解剖特點(diǎn)之間關(guān)系的報(bào)道[41-43]。本研究將文冠果性別分化各時(shí)期的外部形態(tài)特點(diǎn)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化與氣象因子對(duì)應(yīng)起來(lái)，可以方便快捷地判斷雌雄花芽分化時(shí)期。

典型的植物雌性不育主要表現(xiàn)為花柱與子房的異常發(fā)育[44]。文冠果雄能花雌性器官敗育有兩種情況，一種是雌蕊無(wú)花柱和柱頭，僅由瘦癟的子房組成，出現(xiàn)在4月2日左右，花蕾橫徑1.76～2.31 mm、縱徑1.72～2.1 mm；另一種是雌蕊外表正常，但子房?jī)?nèi)部發(fā)育異常，出現(xiàn)在4月8日，雄能花花蕾橫徑2.05～4.54 mm、縱徑2.99～5.32 mm，子房和胚珠開(kāi)始出現(xiàn)敗育跡象，此時(shí)≥K有效積溫230.6 ℃。至子房完全敗育，胚珠停止發(fā)育，柱頭嚴(yán)重萎縮，此時(shí)≥K有效積溫達(dá)到311.8 ℃，雌蕊敗育期持續(xù)時(shí)間為8 d左右。

雄性不育是由于植株不能產(chǎn)生正常的花藥和花粉[44]。本研究發(fā)現(xiàn)，文冠果雌能花雄蕊發(fā)育異常比雄能花雌蕊發(fā)育異常發(fā)生時(shí)間晚4 d。當(dāng)花蕾橫徑12.25～18.30 mm、縱徑8.30～10.98 mm，≥K有效積溫達(dá)到264 ℃，空氣平均溫度18 ℃，平均濕度38.75%時(shí)，雌能花單核花粉粒有絲分裂異常，液泡化衰敗。然后，花藥停止生長(zhǎng)，花粉囊不開(kāi)裂，或花藥絨粘層解體不完全，花粉敗育。此時(shí)≥K有效積溫353.1 ℃。雌能花花粉敗育期持續(xù)時(shí)間為7 d左右。

目前，關(guān)于文冠果花的命名常有雌花、雄花、兩性花、可孕花、不孕花[45-47]等多種說(shuō)法。本研究發(fā)現(xiàn)，文冠果2種花都同時(shí)具有雌雄蕊，是后期雌雄蕊發(fā)育程度不同導(dǎo)致性別分化?；诖耍J(rèn)為從功能角度分別定義為“雌能花”和“雄能花”更準(zhǔn)確。

前人研究認(rèn)為文冠果性器官的敗育可能與大小孢子營(yíng)養(yǎng)不足有關(guān)[34-36]。雌能花敗育的花藥可能缺少某些細(xì)胞器，有生理生化代謝上的障礙，因此出現(xiàn)淀粉粒貯藏不足，子房和雄蕊對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)較大，小孢子因得不到足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而敗育[48]。胡青對(duì)2種類(lèi)型花雌蕊發(fā)育情況比較研究發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶和過(guò)氧化氫酶的一些特殊酶帶和差異蛋白與子房的萎縮和胚珠的不正常發(fā)育有關(guān)[36]。本研究推測(cè)溫度有可能會(huì)影響文冠果雌雄性器官發(fā)育相關(guān)酶和蛋白的活性變化，但尚有待深入研究。此外，由于文冠果頂芽多為雌能花，側(cè)芽多為雄能花，推測(cè)內(nèi)源激素水平、營(yíng)養(yǎng)狀況對(duì)性別分化也有重要影響，這些因素的作用方式和機(jī)理都尚需要深入研究。

另外，本研究?jī)H觀測(cè)了雌能花雄蕊和雄能花雌蕊敗育的發(fā)生過(guò)程和對(duì)應(yīng)的氣象條件，但要準(zhǔn)確建立氣象因素(溫、濕度等)與性別分化過(guò)程的關(guān)系，還需要多年連續(xù)觀測(cè)的數(shù)據(jù)來(lái)分析其相關(guān)性，建立回歸方程，才能得出規(guī)律性結(jié)論。而且，可以在多個(gè)地點(diǎn)和林分進(jìn)行連續(xù)觀測(cè)，得出更完整準(zhǔn)確的結(jié)論。