王新濤，楊 青，代資舉，郝俊杰，王 艷，張瑩瑩，李保全*

(1 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物設(shè)計(jì)中心, 鄭州 450002；2 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所, 鄭州 450002)

植物在應(yīng)對(duì)病原菌侵害時(shí)形成一系列的防御機(jī)制，其中水楊酸誘發(fā)的系統(tǒng)獲得抗性(systemic acquired resistance, SAR)以及茉莉酸和乙烯介導(dǎo)的誘導(dǎo)性系統(tǒng)抗性(induced systemic resistance, ISR)能有效抑制病原物對(duì)植物體的侵害[1-2]。研究表明，NPR1(nonexpressor of pathogenesis-related genes 1)是連接這2種抗病機(jī)制的核心調(diào)控基因[3-5]。

自1994年從擬南芥中分離得到NPR1基因以來，研究人員對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)組成、抗病抗逆的作用機(jī)理以及轉(zhuǎn)基因抗病育種等方面做了較為系統(tǒng)的研究。NPR1蛋白在N端包含一個(gè)BTB/ POZ家族結(jié)構(gòu)域，中間區(qū)域包含一個(gè)錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域ANK以及C端的NPR1保守結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域在蛋白與蛋白之間的互作中起著重要作用[6-8]；在細(xì)胞質(zhì)中NPR1蛋白通常以二硫鍵的形式結(jié)合形成多聚體, 受到病原菌侵襲時(shí)NPR1單體開始釋放并進(jìn)入細(xì)胞核，在核內(nèi)與TGA等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,激活相關(guān)防衛(wèi)基因的表達(dá)，最終引起防御反應(yīng)[9-10]；目前，煙草、小麥、水稻、棉花、梨、大豆、油菜等植物中的NPR1基因已經(jīng)被克隆，其中在擬南芥中過表達(dá)AtNPR1基因可以增強(qiáng)對(duì)霜霉菌的抗性，在水稻中過表達(dá)OsNPR1基因能夠明顯提高對(duì)白葉枯病的抗性，在小麥中過量表達(dá)AtNPR1 增加了對(duì)赤霉病菌的抗性，這些轉(zhuǎn)基因研究結(jié)果表明NPR1介導(dǎo)的抗性途徑可能是保守的途徑[11-15]；同時(shí)NPR1本身沒有抑菌活性且對(duì)病原菌沒有嚴(yán)格的種屬專一性，它主要是誘發(fā)下游基因的多種防衛(wèi)反應(yīng)，使植物體內(nèi)產(chǎn)生廣譜抗性[16]。

玉米粗縮病(maize rough dwarf disease, MRDD)是黃淮地區(qū)玉米主產(chǎn)區(qū)的主要病害，攜帶水稻黑條矮縮病毒的灰飛虱是其主要傳播途徑[17-18]。迄今尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)粗縮病完全免疫的材料，少量的高抗材料主要來自美國雜交種78599 選系，其遺傳基礎(chǔ)較窄[19-20]。NPR1基因作為調(diào)控植物抗病反應(yīng)的關(guān)鍵因子，在植物水平抗性中起著重要作用，目前還未見玉米NPR1在粗縮病抗性方面的研究報(bào)道。本研究以玉米粗縮病高抗自交系D863F為供試材料，克隆了玉米ZmNPR1基因全長(zhǎng)序列，對(duì)該基因的生物信息學(xué)特征進(jìn)行分析，采用熒光定量PCR技術(shù)研究該基因在水稻黑條矮縮病毒侵染后不同階段的動(dòng)態(tài)表達(dá)，檢測(cè)了其在玉米不同部位的表達(dá)差異，對(duì)于揭示玉米ZmNPR1與粗縮病的相互作用并探討其抗病機(jī)制具有十分重要的意義。

1 材料和方法

1.1 材 料

以玉米高抗粗縮病自交系D863F為材料[21]，供試材料種植行長(zhǎng)2 m，行距0.6 m，每行10株，株距0.25 m。2017年4月在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院原陽試驗(yàn)基地種植，播種后加蓋防蟲網(wǎng)，幼苗長(zhǎng)至3片葉時(shí)放入帶毒灰飛虱(攜帶水稻黑條矮縮病毒，Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)進(jìn)行接種處理。取放蟲后0、24和72 h的葉片；在玉米散粉吐絲期取葉片、莖、根、雄穗、雌穗以及花絲等不同部位，所有樣品經(jīng)液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用，每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 方 法

1.2.1玉米DNA和RNA提取及cDNA第一鏈合成采用CTAB法提取玉米葉片DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA，樣品保存在-20 ℃冰箱備用。利用TRIzol法提取樣品總RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，RNA樣品保存在-80 ℃冰箱備用。使用PrimeScript RT-PCR Kit(TaKaRa)試劑盒，以不同玉米材料總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1.2.2玉米ZmNPR1基因的克隆根據(jù)NCBI GenBank中玉米NPR1 基因的mRNA序列(NM_001154115)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增ZmNPR1全長(zhǎng)引物：ZmNPR1-F(CCCTCACCTTATTCCCTGTAGC)和ZmNPR1-R(CCT-GCCATGTTTCCTTATGTTC)。以D863F 基因組DNA和反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，DNA/cDNA模板 1 μL、10×PCR buffer 2 μL、2.5 mmol/L dNTP mix 1 μL、上下游引物各 1 μL、LaTaq酶 0.3 μL、ddH2O 18.7 μL。PCR程序：95 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃變性 1 min，52 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 3 min，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃繼續(xù)延伸 10 min。將擴(kuò)增片段回收后連接至pMD18-T載體，在上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3ZmNPR1的生物信息學(xué)分析利用NCBI的ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)、CCD(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/Structure/cdd/ docs/cdd_search.html)工具預(yù)測(cè)基因ORF和進(jìn)行蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域分析；使用ExPAsy的Compute pI/MW(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html)工具計(jì)算蛋白質(zhì)的分子量及等電點(diǎn)；利用 cNLS Mapper(http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/)預(yù)測(cè)核定位信號(hào)；利用DNAMAN8軟件進(jìn)行蛋白序列比對(duì)。

1.2.4ZmNPR1實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)分析根據(jù)已克隆的ZmNPR1 cDNA序列設(shè)計(jì)熒光定量引物DF1(GCTGCCGAAACCGCTTGA)和 DR1(CGACGCGAACGTGATGGAC)，以葉片、莖、根、雄穗、雌穗和花絲作為不同組織材料進(jìn)行取樣；以侵染后不同時(shí)期的葉片為材料取樣，未侵染植株葉片為對(duì)照；甘油醛-3-磷酸-脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)引物為DF2(CCATCACTGCCACACAGAAAAC)和DR2(AGGAACACGGAAGGACATACCAG)。反應(yīng)體系為15 μL，其中SYBR Premix ExTaq(TaKaRa) 7.5 μL、上下游引物各0.6 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 5.3 μL。定量PCR程序：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，54 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)，最后進(jìn)行熔解曲線分析，用 Bio-Rad Miniopticon Real-Time PCR儀擴(kuò)增。數(shù)據(jù)釆用2-ΔΔCT算法進(jìn)行基因的相對(duì)表達(dá)量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米ZmNPR1基因的克隆

分別以玉米自交系D863F的cDNA和gDNA為模板，克隆得到玉米ZmNPR1基因(GenBank登錄號(hào)為MH619241)的cDNA和gDNA序列(圖1)。其中cDNA全長(zhǎng)2 442 bp，包含一個(gè)1 866 bp完整開放閱讀框，編碼621個(gè)氨基酸， 5′端非編碼區(qū)423 bp， 3′端非編碼區(qū)153 bp。ZmNPR1的gDNA序列全長(zhǎng)3 727 bp，通過MaizeGDB數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，該基因位于玉米第8染色體的8.09區(qū)段。利用DNAMAN8對(duì)ZmNPR1的cDNA和gDNA序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明ZmNPR1基因包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。

2.2 ZmNPR1基因的生物信息學(xué)分析

經(jīng)預(yù)測(cè)ZmNPR1基因ORF編碼的蛋白分子量為67.61 kD，等電點(diǎn)為5.46。利用 cNLS Mapper預(yù)測(cè)在C端有一段核定位信號(hào)(圖3)。NCBI的CCD分析保守結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)蛋白N端具有BTB保守結(jié)構(gòu)域，中間部分包含一個(gè)錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域ANK， C端有一段NPR1保守結(jié)構(gòu)域(圖2)。

2.3 ZmNPR1同源及進(jìn)化分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫查找到14種植物的NPR1蛋白序列，采用鄰接法(neighbor-joining)與玉米ZmNPR1蛋白序列對(duì)比并建立了一個(gè)無根分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。系統(tǒng)進(jìn)化分析將15個(gè)不同植物的NPR1蛋白劃分為2組，其中ZmNPR1與小麥、大麥、高粱、水稻、百合、香蕉、大豆、沙梨和煙草的NPR1蛋白聚為一類，且與高粱的相似性最高，達(dá)到97%。

2.4 水稻黑條矮縮病毒誘導(dǎo)的表達(dá)分析

qRT-PCR分析表明，在帶毒灰飛虱未侵染D863F時(shí)，ZmNPR1表達(dá)量較低；在侵染1 d后，抗性材料D863F中ZmNPR1基因被迅速誘導(dǎo)；隨著侵染時(shí)間的增加，ZmNPR1的表達(dá)量持續(xù)上升，在侵染后第3天表達(dá)量約為未侵染時(shí)的2.87 倍，而ZmNPR1在對(duì)照組中的表達(dá)變化較小且表達(dá)量較低(圖5)。

2.5 不同部位的組織特異性表達(dá)分析

組織特異性實(shí)時(shí)熒光定量分析表明：ZmNPR1在不同器官中均有表達(dá)，在雌穗中的表達(dá)量最高，雄穗中的表達(dá)量最低，其中在雌穗中的表達(dá)量約為雄穗中的8.78倍，葉片、花絲、莖、根中的表達(dá)量次之(圖6)。

M. DNA marker 10 000 bp；1. cDNA；2. gDNA圖1 ZmNPR1基因 PCR 擴(kuò)增Fig.1 The PCR amplified product of ZmNPR1 gene

圖2 ZmNPR1蛋白功能性位點(diǎn)分析Fig.2 Conserved domain analysis of ZmNPR1 protein

下劃線部分為核定位信號(hào)圖3 ZmNPR1基因開放閱讀框及預(yù)測(cè)氨基酸序列The nuclear localization signal is underlinedFig.3 ORF of ZmNPR1 gene and the corresponding amino acid sequence

圖4 不同物種間NPR1蛋白的進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of NPR1 protein homologues from different species

不同小寫字母代表0.05水平差異顯著圖5 ZmNPR1在病毒侵染后不同時(shí)期的表達(dá)Different normal letters represent significant difference at 0.05 levelFig.5 The expression pattern of ZmNPR1 in different periods after RBSDV induction

不同小寫字母代表0.05水平差異顯著圖6 ZmNPR1在不同組織的表達(dá)Different normal letters represent significant difference at 0.05 levelFig.6 Relative abundance of the ZmNPR1 transcripts in different maize tissues

3 討 論

玉米粗縮病在中國玉米主產(chǎn)區(qū)黃淮海地區(qū)有不同程度的發(fā)生，造成部分地區(qū)玉米減產(chǎn)甚至絕收，嚴(yán)重影響玉米生產(chǎn)的穩(wěn)定性，因此培育抗粗縮病品種是當(dāng)前玉米育種的主要目標(biāo)之一[18]。研究表明NPR1基因參與植物SAR 和ISR 的建立，對(duì)于植物產(chǎn)生廣譜抗性至關(guān)重要[22-23]?；贜PR1在植物抗病過程中的重要作用，分析玉米ZmNPR1基因的結(jié)構(gòu)組成及在水稻黑條矮縮病毒誘導(dǎo)下的表達(dá)情況對(duì)闡明玉米抗粗縮病機(jī)制具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，在受到外源物質(zhì)信號(hào)誘導(dǎo)后，擬南芥NPR1 蛋白和其他蛋白質(zhì)在核內(nèi)選擇性的互作進(jìn)而激活相關(guān)SAR基因[7, 24]。本研究從高抗粗縮病玉米自交系中克隆得到ZmNPR1基因，并對(duì)其進(jìn)行了初步的生物信息學(xué)分析。玉米ZmNPR1蛋白與其他已報(bào)道的NPR1類基因的蛋白保守結(jié)構(gòu)域具有很高的相似性，在其N端和中間具有NPR1家族典型的BTB和ANK保守結(jié)構(gòu)域，C端預(yù)測(cè)有核定位信號(hào)，玉米ZmNPR1蛋白可能在細(xì)胞核中通過保守結(jié)構(gòu)域與其他下游蛋白產(chǎn)生互作，并誘導(dǎo)產(chǎn)生多種抗病反應(yīng)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，同為禾本科的玉米、高粱、水稻、小麥、大麥之間NPR1蛋白的相似性較高，與擬南芥NPR1蛋白的相似性只有41%，暗示了玉米ZmNPR1基因在進(jìn)化過程中除了保留NPR1類基因的基本功能外，可能還具有新的作用機(jī)制，需要進(jìn)一步深入研究。

在水稻中過量表達(dá)NPR1 能明顯提高其對(duì)水稻白葉枯病菌的抗性，接種赤霉菌后小麥TaNPR1能迅速響應(yīng)赤霉菌的誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)，表明NPR1類基因在單子葉植物中對(duì)多種病害的抗性起重要作用[12-13]。本研究結(jié)果還表明，水稻黑條矮縮病毒侵染玉米后ZmNPR1基因能夠快速上調(diào)表達(dá)，并且后期在不同部位也檢測(cè)到該基因的組成型表達(dá)，推測(cè)ZmNPR1基因在玉米抵抗水稻黑條矮縮病毒中扮演關(guān)鍵的角色，在玉米的生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要作用。相關(guān)QTL定位發(fā)現(xiàn)玉米粗縮病受多個(gè)數(shù)量性狀基因調(diào)控，致病機(jī)理復(fù)雜，目前還沒有克隆到目標(biāo)抗性基因[20]。本研究中玉米ZmNPR1 基因cDNA和gDNA的獲得及病毒誘導(dǎo)后的表達(dá)模式為深入進(jìn)行玉米粗縮病抗病機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。