屈新運，秦苗苗，趙桂紅,2，張?zhí)煲?，胡向陽，?燾*

(1 西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室，陜西師范大學，西安 710119； 2 長安區(qū)第八中學，西安 710106)

芥子油苷(glucosinolates，GS)主要存在于十字花科植物，是一種具有抗蟲、抗病活性的次級代謝產(chǎn)物[1]。在植物體內(nèi)天然存在的芥子油苷達200多種[2-3]，其生物合成前體主要是氨基酸，根據(jù)側鏈的不同分為脂肪族芥子油苷、吲哚族芥子油苷和芳香族芥子油苷[4]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)中芥子油苷的生物合成途徑主要包括前體氨基酸側鏈延伸、核心結構形成和次級修飾3個步驟。在側鏈延伸過程中，前體氨基酸在CYP79F家族的側鏈專一性細胞色素P450單加氧酶的催化作用下產(chǎn)生相應的醛肟；之后在CYP83家族的細胞色素P450催化下，醛肟被氧化成不穩(wěn)定的酸式硝基化合物或氧化腈[5]。在擬南芥脂肪族芥子油苷的合成過程中，CYP79F1和CYP79F2能夠催化甲硫氨酸等脂肪族前體氨基酸轉(zhuǎn)化為相應的醛肟[6]，其中CYP79F1調(diào)控長鏈或短鏈脂肪族芥子油苷的合成，而CYP79F2主要調(diào)控短鏈脂肪族芥子油苷的合成[7]；過表達CYP79F1和CYP79F2能夠使得短鏈脂肪族芥子油苷的含量增加7倍，同時吲哚族芥子油苷的含量也有一定程度的上升[8]。此外，CYP79F1在西蘭花(BrassicaoleraceaL.var.italica)中的過表達研究結果表明，轉(zhuǎn)基因植株中短鏈脂肪族芥子油苷4MSOP和4MSOB均有顯著增加[9]。在中國白菜(Brassicapekinensis)中過表達脂肪族芥子油苷合成的關鍵酶基因MAM1、CYP79F1和CYP83A1，可以顯著提高脂肪族乃至總芥子油苷的含量[10]。由此可見，CYP79F1基因在不同的十字花科植物芥子油苷的生物合成過程中均發(fā)揮了十分重要的作用。

菘藍(IsatisindigoticaFort.)是十字花科(Cruciferae)菘藍屬(Isatis)二年生草本植物，其干燥的根和葉即“板藍根”和“大青葉”，二者均為歷版藥典所收錄，具有清熱解毒、抗菌消炎[11-12]、增強免疫力[13]、防癌抗癌[14-15]等功效。目前從菘藍中分離得到的化學成分主要包括生物堿類、含硫化合物、有機酸類及芥子苷類化合物等[16]，芥子油苷類化合物則因其具有抗癌功效而被廣泛關注，關于這一物質(zhì)在菘藍中的生物合成過程和分子調(diào)控機理鮮有報道。迄今為止，菘藍中部分參與芥子油苷生物合成過程的關鍵酶基因及相關轉(zhuǎn)錄因子已被相繼克隆，包括CYP450基因家族的IiCYP83A1[17]和IiCYP83B1[18]，以及轉(zhuǎn)錄因子IiMYB34[19]等。此外，CYP79F1也先后在小白菜(BrassicacampestrisL. ssp.chinensisvar.communis)[20]、西蘭花[9]和芥藍(BrassicaalboglabraL. H. Bailey)[21]中被克隆，但其生物學功能還有待進一步研究。

本研究首次從菘藍中克隆得到與脂肪族芥子油苷合成相關的CYP79家族的IiCYP79F1基因，為后期該基因的功能研究奠定了基礎，同時也為后期培育芥子油苷含量升高的菘藍新品種提供了可能。

1 材料與方法

1.1 材 料

菘藍(IsatisindigoticaFort.)種子為本實驗室留存，播種于實驗室溫室大棚中，培養(yǎng)條件為：溫度(25±2)℃；晝/夜光周期16 h /8 h；濕度60%～80%。

1.2 方 法

1.2.1菘藍總RNA提取和cDNA合成取菘藍新鮮葉片，置液氮中速凍，并于-80 ℃保存。按照植物總RNA提取試劑盒(購自西安淳風生物科技有限公司)流程提取菘藍葉片總RNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度；再利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自寶生物工程有限公司)，對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，-20 ℃保存。

1.2.2菘藍基因組DNA提取取菘藍植株的新鮮葉片，按照植物基因組DNA提取試劑盒(購自天根生化科技有限公司)流程提取菘藍葉片gDNA，-20 ℃保存。

1.2.3基因克隆與鑒定依據(jù)本實驗室的菘藍轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫信息，搜索CYP79F1基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計上游引物F(5′-ATGACAATGATGATGATGAGC-3′)和下游引物R(5′-TCAAGAGCGGAATTTTGGAT-3′)，送至西安擎科澤西生物技術有限公司合成。分別以菘藍cDNA和gDNA為模板，參考PrimeSTAR?HS DNA 聚合酶試劑盒說明進行PCR擴增。擴增程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸2 min；共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。將所得 PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，并利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購自天根生化科技有限公司)進行目的片段純化，最后采用AidLab零背景pTOPO-Blunt Simple平末端克隆試劑盒(購自艾德萊生物科技有限公司)將載體與目的片段連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并送測序鑒定。

1.2.4生物信息學分析利用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找目的基因的開放閱讀框，Perot-Param(http://web.expasy.org/protparam/)分析相應蛋白的理化性質(zhì)，TMHMM 2.0 Server(http://web.expasy.org/protparam/)分析該蛋白的跨膜結構域，Psort Prediction(http://psort.hgc.jp/form.html)預測該蛋白的亞細胞定位，SignalP-4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測該蛋白是否具有信號肽，ExPASy NetPhos 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分析該蛋白的磷酸化位點，ScanProsite tool(http://prosite.expasy.org/scanprosite/)分析該蛋白的保守結構域，SOPMA(https://npsa-prabi. ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma)和Swiss Model(https://www.swissmodel.expasy.org/)分別分析該蛋白的二、三級結構。從NCBI搜索親緣關系較近物種的CYP79F1序列，利用MEGA 5.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5基因表達模式分析分別以菘藍根、莖、葉、花、果，萌芽期(10 d)、幼苗期(30 d)、生長期(90 d)和花期的葉片，500 μmol/L MeJA、10 mmol/L Ag+、4 ℃低溫、9.0%葡萄糖(質(zhì)量分數(shù))、300 μmol/L SA，及機械損傷處理后的葉片cDNA為模板，根據(jù)目的基因保守區(qū)序列設計熒光定量上游引物F(5′-GGAGTTAGACGAAGTGGTGGGA-3′)和下游引物R(5′-CCGAGGGTGGTATCTTGACG-3′)。以管家基因IiActin(AY870652.1)作為內(nèi)參基因，其引物序列為F(5′-AGGAATCGCTGACCGTATG-3′)和R(5′-TGGACCCGACTCATCGT-ATT-3′)。采用qRT-PCR技術，分別檢測目的基因在菘藍不同組織部位、不同發(fā)育時期，以及不同誘導子處理條件下的表達情況。

2 結果與分析

2.1 菘藍CYP79F1基因的克隆

分別以菘藍的cDNA和gDNA為模板，利用特異性引物進行PCR擴增，獲得長度約為1 600和2 200 bp擴增片段(圖1)，產(chǎn)物經(jīng)回收純化、測序分析后顯示，該基因的基因組全長為2 109 bp，含有3個外顯子及2個內(nèi)含子；ORF區(qū)為1 626 bp，編碼541個氨基酸(圖2)。Blast比對發(fā)現(xiàn)，該基因與西蘭花CYP79F1核酸序列的相似性達93%，將其命名為IiCYP79F1，GenBank登錄號為KY774689.1。

2.2 IiCYP79F1編碼蛋白的性質(zhì)與結構分析

利用Perot-Param軟件對IiCYP79F1編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進行分析，IiCYP79F1蛋白分子量為61.58 kD，分子結構式為C2759H4358N756O783S29，等電點為8.61，屬于堿性蛋白質(zhì)；不穩(wěn)定系數(shù)為39.43，說明該蛋白較為穩(wěn)定，N-端為甲硫氨酸(Met)；總平均親水性GRAVY值為-0.296，為親水性蛋白。進一步對IiCYP79F1跨膜結構域、信號肽、亞細胞定位及磷酸化位點進行分析顯示，該蛋白含有2個跨膜結構域，分別位于氨基酸第15～37位(由外向內(nèi))和476～498位(由內(nèi)向外)，無信號肽，屬于非分泌蛋白，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(可信度：0.685)和質(zhì)膜(可信度：0.640)上；含有25個Ser位點、13個Thr位點和5個Tyr位點，共有43個蛋白激酶磷酸化位點，推測IiCYP79F1可能受蛋白磷酸激酶的調(diào)控。

利用ScanProsite在線軟件對IiCYP79F1保守結構域進行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有保守的血紅素結合域FGtGRRGCVG，位于470～479之間(圖3)。二級結構預測顯示，該蛋白主要由α-螺旋(alpha helix，43.81%)、無規(guī)則卷曲(random coil，35.49%)、延伸鏈(extended strand，13.68%)和β-轉(zhuǎn)角(β-turn，7.02%)組成。利用Swiss Model構建該蛋白的三維結構(圖4)發(fā)現(xiàn)，α-螺旋和無規(guī)則卷曲所占比例較高，其次為延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角，與二級結構預測結果相一致。

M. DL2000; 1. cDNA; 2. gDNA圖1 IiCYP79F1基因的擴增結果Fig.1 PCR amplification results of IiCYP79F1

圖2 IiCYP79F1的核酸及氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and amino acid sequences of IiCYP79F1

2.3 IiCYP79F1編碼蛋白的同源性分析

利用NCBI的Blast程序分析菘藍IiCYP79F1與近緣種蛋白的氨基酸同源性。結果表明，IiCYP79F1編碼蛋白的氨基酸序列與西蘭花(Brassicaoleracea, ACB59213.1)的相似性為94%；與歐洲油菜(Brassicanapus, AGO59948.1)、蕪菁(Brassicarapa, ACR10252.1)和芝麻菜(Erucasativa, AGS49166.1)的相似性均為93%。由多序列比對結果(圖6)可知，菘藍IiCYP79F1與十字花科其他物種CYP79F1的結構相似，均具有保守的血紅素結合域(Heme-binding motif，F(xiàn)GTGRRGCVG)、PERF序列(PERH)和K螺旋(K-helix，ETFR)。利用MEGA 5.0對菘藍IiCYP79F1和近緣種的CYP79F1進行系統(tǒng)進化分析，發(fā)現(xiàn)IiCYP79F1與芝麻菜(Erucasativa, AGS49166.1)的親緣關系最近(圖5)。

圖4 IiCYP79F1蛋白的三級結構預測Fig.4 Predicted 3D structure model of IiCYP79F1

圖5 IiCYP79F1蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree analysis of IiCYP79F1

圖3 IiCYP79F1蛋白的保守結構域分析Fig.3 Conserved domain analysis of IiCYP79F1

黑色方框表示CYP450的保守結構域圖6 IiCYP79F1與其他物種CYP79F1氨基酸序列比對Black box represents the CYP450’s conserved motifsFig.6 Amino acid sequence alignment of CYP79F1 and other species

2.4 IiCYP79F1基因的表達模式分析

采用qRT-PCR法對IiCYP79F1在根、莖、葉、花和果等不同組織部位，以及萌芽期、幼苗期、生長期和花期等不同發(fā)育階段的表達情況進行分析，結果表明：IiCYP79F1在菘藍莖中的表達水平最高，葉和花次之，其表達量由高到低依次為莖>葉>花>果>根(圖7，A)。此外，IiCYP79F1在菘藍不同發(fā)育階段均有表達，幼苗期、生長期和花期的相對表達量顯著高于萌芽期，且以幼苗期表達量最高，達到萌芽期表達量的7.28倍(圖7，B)。由此可見，IiCYP79F1在菘藍不同組織部位和不同發(fā)育時期均有一定的差異表達，具有明顯的時空特異性。

不同小寫字母代表相對表達量在0.05水平上差異顯著。圖7 IiCYP79F1基因在菘藍不同組織、不同發(fā)育時期和不同誘導處理下的表達分析Different normal letters indicated significant difference for the relative expression at 0.05 levelFig.7 Expression patterns of IiCYP79F1 of I. indigotica Fort. for different tissues, stages and elicitors

此外，本研究還對IiCYP79F1在不同誘導子處理后的表達情況進行了分析。由圖7,C可知，IiCYP79F1在MeJA處理3 h后表達量顯著升高，并在6 h達到峰值，為對照組的11.09倍，此后，隨著處理時間的延長，其表達水平下降，并于72 h降至對照水平；Ag+也能夠有效促進IiCYP79F1的表達，處理12 h后該基因的表達量達到最大值，為對照的14.05倍，總體呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢；葡萄糖對IiCYP79F1基因的表達呈明顯的促進作用，IiCYP79F1基因在葡萄糖處理3 h后達到峰值，為對照的11.33倍；機械損傷也可以明顯促進IiCYP79F1的表達，其表達水平在機械損傷48 h后出現(xiàn)峰值，為對照的7.93倍。相反地，低溫處理對IiCYP79F1基因的表達呈現(xiàn)一定的抑制效應，處理1 h后該基因的表達降至對照的3.12%，48 h后僅為對照的1.66%；同時，其表達也受到SA的抑制作用，處理1 h后其表達即開始下降，并在6 h后下降至對照的14.78%。因此，IiCYP79F1基因顯著響應MeJA、Ag+、低溫(4 ℃)、葡萄糖、SA和機械損傷等信號的誘導，低溫(4 ℃)和SA對該基因的表達呈現(xiàn)明顯的抑制效應，而各類誘導子對該基因的具體誘導機制有待于進一步的深入研究。

3 討 論

芥子油苷及其水解產(chǎn)物在植物的生長發(fā)育過程發(fā)揮多種生物學功能，既能有效地幫助植物抵御昆蟲和病原菌的侵襲，又能參與調(diào)節(jié)植物生長素的代謝，并具有明顯的抗癌活性[22-23]。因此，篩選和改良富含芥子油苷的植物品種已成為十字花科植物研究的熱點。本研究以菘藍為試驗材料，成功克隆了參與芥子油苷生物合成的關鍵酶基因IiCYP79F1，并進行了生物信息學分析，探討了其在不同組織、不同生長發(fā)育階段，以及各種誘導子處理條件下的表達情況，相關研究結果均為首次報道。

芥子油苷的生物合成途徑主要有細胞色素P450的CYP79和CYP83兩個家族參與[24]。CYP79家族催化氨基酸形成相應的乙醛肟，CYP83家族進一步催化乙醛肟生成不穩(wěn)定的酸式硝基化合物[25]。CYP79F1編碼的蛋白主要負責催化甲硫氨酸向芥子油苷前體乙醛肟的轉(zhuǎn)化，且對短鏈脂肪族芥子油苷的合成起重要作用[26]。本研究結果表明，菘藍IiCYP79F1基因?qū)儆诩毎豍450基因家族成員，編碼541個氨基酸，與西蘭花CYP79F1的序列具有較高的相似性；該蛋白屬于堿性親水蛋白，含有2個跨膜結構域，無信號肽；主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和質(zhì)膜上，含有25個Ser位點、13個Thr位點和5個Tyr位點，共計43個蛋白激酶磷酸化位點；此外，該蛋白具有保守的血紅素結合域：FGtGRRGCVG，位于470～479位點之間；其氨基酸序列與西蘭花CYP79F1的氨基酸序列相似性最高，并與芝麻菜的親緣關系最近。

芥子油苷的合成受到許多非遺傳因素的影響。如茉莉酸甲酯能夠促進油菜(BrassicanapusL.)和芥菜(BrassicajunceaL.)中I3M的積累[27]；經(jīng)水楊酸處理的油菜葉片中芥子油苷總量顯著提高[28]。在甘藍型油菜中，子葉、葉和莖中CYP79F1的轉(zhuǎn)錄水平高于花和角果，而在葉的發(fā)育過程中，其轉(zhuǎn)錄水平在年幼階段表達量較低[29]；芥藍中CYP79F1在莖、葉片和子葉中的表達量高于花和種子中的表達量[15]。本研究對菘藍IiCYP79F1在不同組織部位的表達模式進行了分析，發(fā)現(xiàn)其在莖中的表達量最高，其次為葉、花、果和根；此外，該基因在幼苗期的表達量最高，顯著高于其他生長發(fā)育階段，為萌芽期的7.28倍。因此，IiCYP79F1的表達具有明顯的組織特異性，但與已報道的十字花科其他植物中CYP79F1基因的表達模式存在不同。茉莉酸可以顯著增強擬南芥中芥子油苷生物合成相關的CYP79家族基因的表達[30]；羽衣甘藍(Brassicaoleraceavar.acephalaf.tricolor)中，CYP79F1基因的表達被MeJA誘導上調(diào)[31]；芥藍中脂肪族芥子油苷合成相關基因CYP79F1在葡萄糖處理后6 h表達上調(diào)，并在18 h達到最大值[32]；而低溫脅迫能顯著降低羽衣甘藍中總芥子油苷的含量[33]。本研究結果發(fā)現(xiàn),MeJA、Ag+、葡萄糖、機械損傷上調(diào)了IiCYP79F1的表達，而SA、低溫則抑制其表達，該基因的表達模式與十字花科其他植物存在一定的相似之處，但也有其特異性，具體的響應機制仍需要深入探討。

本研究對菘藍IiCYP79F1進行了克隆，通過生物信息學分析和表達模式的研究，為該基因的功能研究奠定了基礎，也為進一步開展菘藍芥子油苷生物合成與調(diào)控機理的研究提供了依據(jù)。隨著更多的CYP79家族成員基因的克隆和功能驗證，將有助于切實闡明菘藍芥子油苷的合成機理，為生物合成芥子油苷提供有效途徑，也為通過基因工程手段提高菘藍和十字花科其他植物的芥子油苷含量提供新的思路和途徑。