◎ 李云輝

（昭通市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心，云南 昭通 657000）

通常，牛奶的質(zhì)量問(wèn)題在于其中的抗生素殘留以及其他一些人為添加的物質(zhì)等。即使可以控制人為添加物質(zhì)的方式來(lái)提高牛奶質(zhì)量，但抗生素的殘留仍無(wú)法被有效控制。氨基糖苷類化合物（Aminoglycosides，AGs）是由氨基環(huán)醇、氨基糖以及其他糖類組成的抗生素的總稱。它是一種由氨基糖與氨基環(huán)醇以過(guò)氧橋方式連接而形成的苷類。根據(jù)氨基糖苷類的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可分為5種對(duì)環(huán)己醇衍生物的分子結(jié)構(gòu)與取代基，且其在實(shí)際臨床大多是鏈霉胺衍生物和2-脫氧鏈霉胺衍生物。這類抗生素在治療和預(yù)防畜牧類動(dòng)物的疾病方面有十分顯著的作用，是牛奶中一大類殘留的抗生素來(lái)源，其抗菌機(jī)制通過(guò)阻礙細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成來(lái)完成，對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌有顯著的抗菌效果。長(zhǎng)期攝入含有此類抗生素的牛奶會(huì)在人體內(nèi)產(chǎn)生富集作用，副作用很大，有可能導(dǎo)致耳毒性以及腎毒性等疾病。

目前的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法中牛奶抗生素的檢測(cè)多是利用微生物抗體反應(yīng)的定性檢測(cè)方法，沒(méi)有對(duì)這類化合物直接進(jìn)行專一檢測(cè)和定量。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)氨基糖苷類抗生素的研究大多集中于種類、結(jié)構(gòu)和在原藥品中的含量檢測(cè)，少量有在食品中殘留進(jìn)行檢測(cè)分析研究報(bào)道，但前處理都采用離子交換反向吸附固相萃取柱，或者使用親水-親脂平衡固相萃取柱來(lái)對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行凈化，通過(guò)以多空二乙烯基苯為框架結(jié)構(gòu)，雖具備很好的親水性和親脂性和更廣泛的pH值適應(yīng)性。但是，這兩類方法依舊無(wú)法達(dá)到很好的效果，選擇性不高，分離效果不佳。

本文提出一種利用分子印跡技術(shù)發(fā)展而來(lái)的固相萃取柱法，以鏈霉素為模版的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)從復(fù)雜基質(zhì)中對(duì)AGs的抗生素進(jìn)行有效的選擇性分離。以期通過(guò)低成本、易操作的技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)氨基糖苷類檢測(cè)前處理，再利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[1]（HPLC-MS/MS）技術(shù)對(duì)AGs抗生素在牛奶中的殘留量進(jìn)行檢測(cè)，達(dá)到滿意的效果。HPLC-MS/MS通常可以檢測(cè)牛奶中的β-內(nèi)酰胺類[2]，四環(huán)素類[3]，大環(huán)內(nèi)酯類[4]，磺胺類以及氨基糖苷類。對(duì)于利用HPLC-MS/MS來(lái)對(duì)AGs殘留量進(jìn)行檢測(cè)的方法，其前處理要求較高，乳制品樣品的基質(zhì)復(fù)雜，含有大量的內(nèi)源性化合物會(huì)對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生一定的干擾。

2 實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用到的技術(shù)

2.1 HPLC-MS/MS技術(shù)的前期處理

HPLC-MS/MS技術(shù)成為了現(xiàn)代不可替代的檢測(cè)分析技術(shù)。HPLC是一種高壓高效液相分離技術(shù)，而質(zhì)譜的操作需要在真空環(huán)境中才能進(jìn)行；并且在檢測(cè)過(guò)程中液相色譜通常采用無(wú)機(jī)鹽，質(zhì)譜的緩沖劑一般是采用揮發(fā)性的緩沖鹽。為了彌補(bǔ)兩者使用的一些基本物質(zhì)上的沖突，HPLC-MS/MS技術(shù)中采用了大氣壓離子化技術(shù)來(lái)彌補(bǔ)這一缺陷。

2.2 分子印跡技術(shù)

分子印跡技術(shù)是一種模板分子技術(shù)，即通過(guò)分子印跡聚合物和聚合物單體接觸會(huì)形成一個(gè)多點(diǎn)的作用，并通過(guò)這種聚合過(guò)程將記憶的作用下降。在模板分子移除后，聚合物會(huì)以模板分子空間結(jié)構(gòu)形式來(lái)匹配的多點(diǎn)的孔，這些孔將模板分子及其類似物與識(shí)別特性的選擇。

其基本步驟如下：①印跡聚合單體的產(chǎn)生。向致孔劑（一種含有模板印跡分子的溶劑）中加入功能單體（常用的有硅氧烷功能單體、偶氮功能單體和復(fù)合功能單體），根據(jù)共價(jià)或非共價(jià)作用，使模板分子與功能單體依靠官能團(tuán)之間產(chǎn)生配合作用，先形成主客印跡聚合單體。②剛性聚合物的形成。加入交聯(lián)劑、反應(yīng)劑，在引發(fā)劑、光或熱等條件下引發(fā)單體聚合，使主客印跡聚合單體與交聯(lián)劑通過(guò)自由基產(chǎn)生共聚合，在模板分子周圍包裹成高聯(lián)的剛性聚合物。③洗脫。將剛性聚合物中的印跡分子通過(guò)固相萃取柱洗脫和解離出來(lái)。

本文通過(guò)使用分子印跡技術(shù)進(jìn)行固相萃取，其分子印跡材料的形成過(guò)程如圖1所示。通過(guò)分子印跡技術(shù)進(jìn)行固相萃取，可以對(duì)目標(biāo)痕量分析物產(chǎn)生明顯效果的富集作用，即使在基質(zhì)復(fù)雜的情況下也能獲得極佳的選擇性，同時(shí)有效分離和模板分子物化性質(zhì)相似的待測(cè)物質(zhì)，并且此分析方法的表現(xiàn)也具有很高的穩(wěn)定性。

圖1 分子印跡材料的形成基本過(guò)程圖

本文主要以鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿普拉霉素和壯觀霉素6種AGs藥物作為研究對(duì)象，基于分子印跡固相萃取柱，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜是AGs的檢測(cè)的一種有效方法。部分AGs的分子結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2 部分AGs的分子結(jié)構(gòu)示意圖

3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

3.1 儀器與試劑

1261-6420A高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；AB Sciex 5500 QTrap質(zhì)譜儀（美國(guó)Applied Biosystem公司）；Analyst 1.5.1數(shù)據(jù)釆集及處理系統(tǒng)。壯觀霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星（純度大于95%），均采購(gòu)自Dr. Ehrenstorfer公司（德國(guó)）；甲酸（FA）、甲醇（MeOH）和乙腈（ACN）購(gòu)自Fisher公司（美國(guó)）；三氯乙酸（TCA）購(gòu)自北京檢測(cè)試劑限公司（中國(guó)）；Oasis HLB和WCX固相萃取柱是用自Waters公司（美國(guó)）；實(shí)驗(yàn)室用超純水由MiUipore超純水機(jī)制備。0.1 mol/L氫氧化鈉溶液，50%甲酸-甲醇：將甲酸與甲醇以1∶1體積比混合均勻至l00 mL。50%甲酸-乙腈：將甲酸與甲醇以1∶1體積比混合均勻至l00 mL。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取一定量標(biāo)準(zhǔn)品配制成l 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用超純水稀釋成l00 mg/L的混合溶液。然后再將此將混合溶液用超純水進(jìn)行制成10～5 000μg/L的系列實(shí)驗(yàn)溶液?？瞻谆|(zhì)溶液：按需量取適量溶液，用空白基質(zhì)配制成50～5 000 μg/L的空白基質(zhì)溶液，待凈化。

3.3 目標(biāo)化合物提取

量取牛奶約5 mL（精確至0.1 mL）放入50 mL具塞離心管中，向其中再加入4 mL的去離子水并使用機(jī)器將其進(jìn)行均勻的混合。加入20 mL乙腈-水（3∶1，V/V）溶液進(jìn)行高速振蕩2 min后，2 000 r/min再離心8 min，提取上層清夜至另外一支新的雞心瓶中。用10 mL上述溶液重復(fù)提取3次，合并上清液于同一雞心瓶中。最后使用0.1 mol/L NaOH將溶液的pH值調(diào)為8.5，待凈化。

3.4 樣品凈化

將提取液在45 ℃環(huán)境下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至余7 mL左右，并加入2 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，將溶液全部上樣，再利用固相萃取柱進(jìn)行處理（使用前依次用3 mL甲醇、3 mL水和3 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液條件化），然后用3 mL磷酸鹽緩沖液沖洗雞心瓶2次，洗液也移至柱上，用2 mL的初始流動(dòng)相定容，過(guò)濾，待供HPLC-MS/MS分析。

3.5 液相色譜條件

載氣：高純氮?dú)猓慌鲎矚猓簹鍤?；源溫度?20 ℃；脫溶劑氣溫度：350 ℃；錐孔電壓（Cone）：18.0 V；毛細(xì)管電壓（Capillary）：3.0 kV；溶劑氣體流量：50.0～1 500.0 L/h錐；碰撞電壓（Collision）：31.0 V；檢測(cè)模式：電噴霧電離源（ESI）負(fù)離子模式，選擇離子檢測(cè)模式（SIR）對(duì)質(zhì)荷比（m/z573）定量、子離子檢測(cè)（Daughter）定性。色譜柱：ODS柱（ACQUITY UPLC BEH 1.7 μm、2.1×50 mm）， 乙 腈 -0.01% 甲酸溶液（31∶69）為流動(dòng)相；柱溫40 ℃；流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量：1 μL。色譜柱（150×3 mm，3 μm）；進(jìn)樣量：30 mL；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.01 mL/L三氟乙酸（B），洗脫梯度：0 min（5.0% A）→5.0 min（30.0% A）→10.0 min（33.5% A）→12.0 min（65.0% A）→17.5 min （65.0% A）→18.0 min（5.0% A）→25.0 min（5.0% A），共25 min。

3.6 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；ESI+；氣簾氣（CUR）壓力25 psi，霧化氣壓力60 psi（GSI），輔助氣體壓力為50 psi（GS）、電噴霧電壓4.5 kV，去溶劑溫度（TEM）為500 ℃，碰撞室出口電壓（CXP）為11 V，Q0入口電壓（EP）為15 V。所選6種目標(biāo)化合物的參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 六種目標(biāo)化合物的參數(shù)表

4 結(jié)果與討論

4.1 色譜柱的選擇

由于氨基糖苷類物質(zhì)的極性大，常用的反相柱不能有效地保留。因此，想要增強(qiáng)氨基糖苷類抗生素物質(zhì)在色譜柱上的停留時(shí)間，需在流動(dòng)相中加入一些易揮發(fā)的離子對(duì)試劑，如七氯乙酸、三氟乙酸等。而這些離子會(huì)殘留在儀器中從而影響到儀器的精確度，會(huì)增加維護(hù)難度。

本文通過(guò)HILIC色譜柱分離樣品，用流動(dòng)相緩沖氨基糖苷類抗生素的分離和峰形和響應(yīng)鹽濃度觀察HILIC色譜柱。從圖3中可知，都使用HILIC色譜柱來(lái)分離氨基糖苷類抗生素時(shí)，阿普拉霉素和慶大霉素的色譜峰有嚴(yán)重拖尾的現(xiàn)象，影響積分。而鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，想要獲得相對(duì)好一些的峰形，可以在流動(dòng)相中加入較高濃度的緩沖鹽（一般為100～140 mmol/L的甲酸銨）。正如前所述，過(guò)高的緩沖鹽濃度揮發(fā)之后會(huì)降低響應(yīng)靈敏度，也會(huì)給質(zhì)譜檢測(cè)器帶來(lái)一定的污染。因此，本文采用一種氨基柱作為色譜柱。通過(guò)使用氨基柱對(duì)6種AGs抗生素的分離結(jié)果如圖3所示。

圖3 加標(biāo)樣品中提取的離子色譜圖

4.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由氨基糖苷類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)可知，該類化合物的分子結(jié)構(gòu)中均含有-OH或者-NH2官能團(tuán)，在質(zhì)譜上存在十分強(qiáng)的正離子響應(yīng)，從而通過(guò)ESI+模式的掃描方式可以得到很好的分析結(jié)果。首先使用1 mg/kg的單標(biāo)進(jìn)行針泵進(jìn)樣注射分析，正離子模式下用Qi母離子進(jìn)行全掃描。在質(zhì)譜正離子模式下，其一級(jí)質(zhì)譜的氨基糖苷[M+2H]2+或[M+H]+分子離子峰，其規(guī)模較大，將分子離子峰選為母離子。之后再對(duì)6種AGs的母離子進(jìn)行二次質(zhì)譜碎裂，可以得到零散的離子峰的信息。以此推斷出待測(cè)樣品的2個(gè)特征離子對(duì)，并進(jìn)一步利用這個(gè)信息在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下優(yōu)化去簇電壓和碰撞能量等儀器條件，經(jīng)優(yōu)化后的6種氨基糖甘類抗生素的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

4.3 MIP固相萃取柱條件優(yōu)化

由于氨基糖苷類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)中含有-0H或者-NH2，易與H+相結(jié)合，因此，上樣液的pH值會(huì)對(duì)待測(cè)樣品在固相萃取柱上的保留造成一定程度的影響。本研究中，考察了不同pH值對(duì)待測(cè)樣品保留的影響。使用1 mg/kg的混合氨基糖甘類溶液上樣，并提取上樣液，進(jìn)行測(cè)試。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)上樣液的pH值為7～7.5時(shí)，所有待測(cè)樣品均無(wú)穿透。洗脫溶劑的優(yōu)化考察了濃度為0%、10%、20%、50%，60%、80%甲酸乙腈作為洗脫溶劑時(shí)對(duì)待測(cè)樣品回收率的影響。使用1 mg/kg的氨基糖苷類溶液上樣，提取洗脫液再進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果表明，當(dāng)洗脫溶劑中的甲酸乙腈含量為50%時(shí)，6種待測(cè)樣品的回收率比較可觀。

4.4 方法回收率與精密度

在空白基質(zhì)中添加3個(gè)濃度（50、200、1 000 μg/L）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)不同添加濃度標(biāo)液均做了6次平行測(cè)試，得到的結(jié)果如表2。從表2中可得，對(duì)于卡那霉素、慶大霉素和阿普拉霉素3種AGs而言，利用分子印跡技術(shù)的方法其回收率達(dá)到50%以上，其精密度（RSD）不到10%。對(duì)于鏈霉素和雙氫鏈霉素而言，本方法的回收率分別是30%和40%，且精密度（RSD）也不到10%。對(duì)于壯觀霉素SPC，本方法的回收率較低僅為5%～9.5%，而且精密度（RSD）為10%～15%。

表2 方法回收率與精密度結(jié)果表

4.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

利用此文中分子印跡技術(shù)的方法對(duì)本實(shí)驗(yàn)室于2016年5—12月期間的100個(gè)乳制品樣品進(jìn)行AGs藥物的檢測(cè)，未檢出AGs。

5 結(jié)論

本研究設(shè)計(jì)的分子印跡固相萃取小柱，能針對(duì)牛奶中氨基糖苷類抗生素實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、靈敏檢測(cè)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法?？疾炝瞬煌盍系墓滔噍腿⌒≈鶎?duì)于牛奶中6種氨基糖苷類抗生素的凈化效果，相比于商品化的固相萃取柱，自制的固相萃取可以有效地凈化乳基，降低基體效應(yīng)，提高反應(yīng)的靈敏度。然而，由于樣品前處理階段的滲透現(xiàn)象仍然存在，希望能夠深入下一步的研究。