杜文炳，冉龍文，張宇，陳凱，楊科花

（江蘇省常州市武進(jìn)區(qū)動(dòng)物檢疫站，常州 213165）

0 引言

牛病毒性腹瀉（Bovine viral diarrhea，BVD）是由牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）感染引起的一種以水樣腹瀉為主要特征，同時(shí)伴隨繁殖障礙以及免疫機(jī)能障礙為主要特征的一種急性高度接觸性傳染病[1]。BVD感染可造成免疫抑制和持續(xù)性感染，造成機(jī)體免疫力低下，極易誘發(fā)其他病原的混合感染或者二次感染，是目前影響肉牛養(yǎng)殖的重要疫病之一[2]。廣大群眾對(duì)于牛肉的需求日益增加，肉牛養(yǎng)殖發(fā)展迅速。但是由于缺乏相應(yīng)的管理經(jīng)驗(yàn)與疫病防控方法，肉牛場(chǎng)BVDV感染引起的腹瀉及相關(guān)疾病時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖戶的經(jīng)濟(jì)效益。結(jié)合一例典型的BVDV病例，探討B(tài)VDV發(fā)病的癥狀以及治療要點(diǎn)，同時(shí)對(duì)BVDV E0蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析，為我國(guó)BVDV防控以及疫苗研發(fā)提供參考數(shù)據(jù)。

1 病例簡(jiǎn)介

2018年初春，某肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生頑固性腹瀉，病程3～5 d不等。發(fā)病早期主要表現(xiàn)為全身癥狀，病畜精神高度萎靡、食欲不振，有的甚至廢絕；大部分病牛表現(xiàn)水樣腹瀉，呈噴射狀，個(gè)別糞便中夾雜血液或黏膜組織碎片，漸進(jìn)性消瘦，部分鼻鏡有潰爛面，反芻停止，體溫在40 ℃左右。牛場(chǎng)技術(shù)人員先期進(jìn)行抗生素治療，但是效果不佳，且患畜日益增加。根據(jù)臨床癥狀和治療情況分析，初步診斷為牛病毒性腹瀉感染。采集患畜的糞便進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室RT-PCR檢測(cè)。

2 RT-PCR檢測(cè)

將采集到的BVDV疑似病料用無(wú)菌PBS進(jìn)行1∶3稀釋，13 000 rpm離心2 min，取上清使用Trizol進(jìn)行常規(guī)RNA提取，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA后使用L1：5ˊ-GGTGTGGAGGAACCTGTTTATGATCAG-3ˊ，L2：5ˊ-CCTTTACTATTACCCGACCTGCAGTCACCTC-3ˊ引物進(jìn)行PCR檢測(cè)檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系如下：12.5 μLMix聚合酶，L1和L2引物各1 μL，cDNA 3 μL，無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min后，94 ℃變形30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物預(yù)期大小為498 bp。PCR循環(huán)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)（見圖1）。M為DL 2 000 marker，1號(hào)泳道為待檢病料，2號(hào)泳道為陽(yáng)性對(duì)照。在1號(hào)泳道出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶，與2號(hào)泳道的條帶大小一致，判斷待檢病料為BVDV陽(yáng)性。

圖1 BVDV的PCR檢測(cè)

3 BVDV E0基因的擴(kuò)增與分析

采取馬文瑞等設(shè)計(jì)的引物對(duì)BVDV E0基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系同2，PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min后，94 ℃變形30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR循環(huán)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。如圖2所示，M為DL2 000 marker，1、2泳道為E0基因擴(kuò)增結(jié)果。將目的片段回收，使用寶生物公司的膠回收試劑盒回收目的片段，連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞于添加有氨芐抗生素的平皿，37 ℃溫箱培養(yǎng)12 h，挑取白斑于添加有氨芐抗生素的液體LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。研究得到的毒株命名為CH-HENAN。以上所述試驗(yàn)耗材均為寶生物工程大連有限公司產(chǎn)品。M 1 2

圖2 BVDV E0基因的擴(kuò)增

將測(cè)序的結(jié)果使用DNA star軟件進(jìn)行序列拼接，與Genbank下載的BVDV E0基因序列構(gòu)建徐彤進(jìn)化樹，如圖3所示，CH-HENAN株序列與BVDV亞型的KU756226株、KF835697和MG950357毒株同為BVDV-1b亞型，而與BVDV-1a亞型和BVDV-2亞型的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。表明目前河南范圍內(nèi)流行的毒株以BVDV-1b亞型為主。

圖3 BVDV 系統(tǒng)進(jìn)化分析

4 討論與結(jié)論

腹瀉是影響肉牛生長(zhǎng)的重要疫病。由于細(xì)菌性腹瀉和病毒性腹瀉在臨床表現(xiàn)十分相似，無(wú)法用肉眼進(jìn)行區(qū)分，因此對(duì)于疫病的確診，特別是病毒性腹瀉的確診必須借助實(shí)驗(yàn)室診斷方法，以區(qū)分牛冠狀病毒、牛輪狀病毒以及牛病毒性腹瀉病毒等病原，進(jìn)而采取相應(yīng)的治療措施。與傳統(tǒng)的病毒中和試驗(yàn)和間接免疫熒光方法相比，研究采用的RT-PCR檢測(cè)方法在分子水平對(duì)病原進(jìn)行鑒定，具有快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。結(jié)果與臨床癥狀相互印證，在很大程度上挽回養(yǎng)養(yǎng)殖戶的損失。因此，在肉牛飼養(yǎng)中，如果出現(xiàn)頑固性腹瀉，抗生素治療無(wú)效，且疫病傳播迅速時(shí)，需要及時(shí)通知當(dāng)?shù)孬F醫(yī)主管部門采用實(shí)驗(yàn)室診斷方法迅速確診，以及時(shí)采取措施，及早控制疫病蔓延。

BVDV根據(jù)基因組序列的差異可以分為BVDV-1和BVDV-22個(gè)基因型，其中有型又可以分為多個(gè)亞型[3]。對(duì)BVDV基因分型研究得知地區(qū)內(nèi)病毒遺傳進(jìn)化情況、進(jìn)化規(guī)律以及抗原位點(diǎn)的變化，為疫苗的研發(fā)提供有效的參考。研究選擇的E0基因是BVDV基因組主要的保護(hù)性蛋白基因，結(jié)果與近期的相關(guān)報(bào)道一致[4]。表明BVDV-1b亞型已成為我國(guó)牛群BVDV流行的優(yōu)勢(shì)基因型，為后續(xù)的診斷方法的研發(fā)以及疫苗制劑的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。