陳 杰
(1.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)系,陜西 漢中 723002;2.西南大學(xué) 藥學(xué)院,重慶 400715)
中藥復(fù)方回陽液是西南大學(xué)藥學(xué)院中藥教研室自制,由人參、丹參、甘草等味中藥組成。該制劑是基于臨床應(yīng)用,源于參附湯基礎(chǔ)上創(chuàng)制的主要用于臨床急救的新藥劑。丹參是唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge的干燥根和根莖,味苦、性涼,有活血祛瘀,養(yǎng)血安神之功效[1]?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明丹參具有增加冠脈血流量,降低心肌耗氧量,保護(hù)缺血性心肌損傷,改善血液循環(huán)、抗血栓、抗高脂血癥、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤等作用[2]。丹參酮ⅡA和丹酚酸B作為丹參的主要活性成分,在這些功效上發(fā)揮著重要作用,同時(shí)也對回陽液的藥效起著重要作用[3-4]。本試驗(yàn)采用反相HPLC法檢測中藥復(fù)方制劑回陽液中丹參酮ⅡA和丹酚酸B的含量,可為該新制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定基礎(chǔ),為新制劑的申報(bào)注冊提供依據(jù)。
LC-20A高效液相色譜儀(日本島津);Hypersil BDS C18色譜柱(大連依利特科學(xué)儀器有限公司);AE240電子分析天平(瑞士梅特勒公司);QYSW-20A超純水儀(重慶前沿水處理設(shè)備有限公司);KQ-250超聲波清洗儀(昆山市超聲波儀器廠)。
品丹參酮ⅡA、丹酚酸B(中國食品藥品檢定研究院),甲醇、乙腈(色譜級,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),甲酸(色譜純,天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司),其他試劑均為分析純,水為超純水。中藥復(fù)方回陽液樣品(共10批),西南大學(xué)藥學(xué)院中藥室自制。
固定相:Hypersil BDS C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×150 mm)。
流動(dòng)相:A為0.4%甲酸溶液,B為乙腈。
梯度洗脫過程中的數(shù)據(jù)如表1所示。
表1 梯度洗脫過程 (v/v)
檢測波長:280 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量10 μL。
2.2.1 對照品溶液的配置
精密稱取丹參酮ⅡA和丹酚酸B對照品適量,置棕色容量瓶中,加甲醇制成每1 mL各含0.2 mg的混合對照品溶液(母液)。
2.2.2 供試品溶液的制備
取回陽液5 mL,于45 ℃揮干溶劑,殘?jiān)蛹状既芙?,并超?0 min,溶液用0.2 μm的微孔濾膜過濾后,轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,甲醇定容至刻度。
將配置好的對照品溶液、供試品溶液以及甲醇溶液(空白溶劑),按照色譜條件進(jìn)樣,結(jié)果如圖1~3所示。
由試驗(yàn)結(jié)果可知,在擬定的色譜條件下,對照品溶液和供試品溶液中丹參酮ⅡA和丹酚酸B的峰形良好,無雜質(zhì)峰干擾,且完全分開,分離度>1.5,理論塔板數(shù)不少于8 000。結(jié)果表明,該方法系統(tǒng)適應(yīng)性良好,符合試驗(yàn)要求。
圖1 丹參酮ⅡA和丹酚酸B的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液
圖2 供試品溶液
圖3 空白溶劑色譜圖(甲醇溶液)
2.4.1 精密度試驗(yàn)
取配置好的丹酚酸B和丹參酮ⅡA混合對照品溶液,按照所述色譜條件,重復(fù)進(jìn)樣6次,測定其峰面積。經(jīng)計(jì)算,丹酚酸B峰面積的RSD=0.79%,n=6;丹參酮Ⅱ峰面積的RSD=0.81%,n=6。結(jié)果表明,該儀器精密度良好。
2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)
取同一批次回陽液6份,依2.2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,并按照色譜條件進(jìn)樣。經(jīng)計(jì)算,同一批回陽液供試品溶液中丹酚酸B峰面積的RSD值是1.37%,n=6;丹參酮ⅡA峰面積的RSD值是2.08%,n=6,結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)建立的方法重復(fù)性良好。
2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)
制備好的供試品溶液,常溫放置,分別于0、6、12、24、36、48 h在2.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣。經(jīng)計(jì)算丹酚酸B和丹參酮ⅡA峰面積的RSD值分別是1.89%(n=6)、1.07%(n=6),結(jié)果表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.4.4 線性關(guān)系的考察
精密吸取2.2.1配置好的丹酚酸B和丹參酮ⅡA混合對照品溶液適量,用甲醇稀釋為6份不同濃度的丹酚酸B和丹參酮ⅡA混合對照品溶液。分別按照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣。以峰面積為縱坐標(biāo),樣品質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)計(jì)算:丹參酮ⅡA的回歸方程是Y=4×107X-72070,R2=0.999 6,線性范圍是2.65~265 μg/mL;丹酚酸B的回歸方程是Y=1×107X-305 38,R2=0.999 3,線性范圍是1.95~195 μg/mL。結(jié)果表明,此色譜條件下丹酚酸B和丹參酮ⅡA峰面積與濃度之間存在良好的線性關(guān)系。
2.4.5 加樣回收試驗(yàn)
取已測含量的供試品溶液9份,每份5mL,分成3組,每組分別加2.2.1制成的混合對照品溶液0.5 mL、1 mL、2 mL,加甲醇定容到10 mL。按照2.2.2方法處理樣品,0.2 un微孔濾膜過濾后,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,測定其峰面積。
經(jīng)計(jì)算,丹參酮ⅡA的平均加樣回收率為99.80 %,RSD%=1.28;丹酚酸B的平均加樣回收率為99.51%,RSD%=2.15%,結(jié)果表明該試驗(yàn)方法加樣回收率良好。
10批次回陽液分別按2.2.2項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液各2份,共計(jì)20份樣品。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。經(jīng)計(jì)算,回陽液中丹酚酸B和丹參酮ⅡA的質(zhì)量濃度是(75.16±3.448)μg/mL、(1.299±0.163 0)μg/mL,其95%的可信限分別是72.69~77.63 μg/mL、1.183~1.416 μg/mL。由此,可以建立回陽液最低限量的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。
丹參作為傳統(tǒng)的活血化瘀中藥已經(jīng)長期且廣泛應(yīng)用于在臨床心腦血管等疾病的治療,療效顯著,不良反應(yīng)小。丹參酮ⅡA具有心臟保護(hù)、擴(kuò)張冠脈、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗凝、抗血栓形成及抑制心肌肥厚作用[6]。丹酚酸B為丹參的有效水溶性成分,具有有抗炎、抗衰老、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗缺血及缺血再灌注損傷等[7],特別是對心腦血管疾病的保護(hù)作用和抗纖維化的作用效果明顯,具有良好的臨床應(yīng)用前景。這些藥理作用與復(fù)方中藥回陽液回陽救逆、改善微循環(huán)、抗休克的功效基本一致。
丹酚酸B是水溶性的、丹參酮ⅡA是脂溶性的,二者極性相差很大,難以使用一種色譜條件將其同時(shí)測定。本試驗(yàn)建立的反相高效液相色譜法操作簡便,能夠同時(shí)測定中藥復(fù)方回陽液中丹參酮ⅡA和丹酚酸B的含量,達(dá)到了“一測多評”的效果,同時(shí)供試品溶液處理簡便,溶液穩(wěn)定性好,檢測方法快捷、準(zhǔn)確、靈敏度高,為建立中藥復(fù)方回陽液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。