陳 杰

（1.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)系，陜西 漢中 723002；2.西南大學(xué) 藥學(xué)院，重慶 400715）

中藥復(fù)方回陽(yáng)液是西南大學(xué)藥學(xué)院中藥教研室自制，由人參、丹參、甘草等味中藥組成。該制劑是基于臨床應(yīng)用，源于參附湯基礎(chǔ)上創(chuàng)制的主要用于臨床急救的新藥劑。丹參是唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge的干燥根和根莖，味苦、性涼，有活血祛瘀，養(yǎng)血安神之功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明丹參具有增加冠脈血流量，降低心肌耗氧量，保護(hù)缺血性心肌損傷，改善血液循環(huán)、抗血栓、抗高脂血癥、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤等作用[2]。丹參酮ⅡA和丹酚酸B作為丹參的主要活性成分，在這些功效上發(fā)揮著重要作用，同時(shí)也對(duì)回陽(yáng)液的藥效起著重要作用[3-4]。本試驗(yàn)采用反相HPLC法檢測(cè)中藥復(fù)方制劑回陽(yáng)液中丹參酮ⅡA和丹酚酸B的含量，可為該新制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定基礎(chǔ)，為新制劑的申報(bào)注冊(cè)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津）；Hypersil BDS C18色譜柱（大連依利特科學(xué)儀器有限公司）；AE240電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；QYSW-20A超純水儀（重慶前沿水處理設(shè)備有限公司）；KQ-250超聲波清洗儀（昆山市超聲波儀器廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與試藥

品丹參酮ⅡA、丹酚酸B（中國(guó)食品藥品檢定研究院），甲醇、乙腈（色譜級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），甲酸（色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司），其他試劑均為分析純，水為超純水。中藥復(fù)方回陽(yáng)液樣品（共10批），西南大學(xué)藥學(xué)院中藥室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

固定相：Hypersil BDS C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×150 mm）。

流動(dòng)相：A為0.4%甲酸溶液，B為乙腈。

梯度洗脫過(guò)程中的數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 梯度洗脫過(guò)程 (v/v)

檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液配制及預(yù)處理

2.2.1 對(duì)照品溶液的配置

精密稱取丹參酮ⅡA和丹酚酸B對(duì)照品適量，置棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 mL各含0.2 mg的混合對(duì)照品溶液（母液）。

2.2.2 供試品溶液的制備

取回陽(yáng)液5 mL，于45 ℃揮干溶劑，殘?jiān)蛹状既芙?，并超?0 min，溶液用0.2 μm的微孔濾膜過(guò)濾后，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

將配置好的對(duì)照品溶液、供試品溶液以及甲醇溶液(空白溶劑)，按照色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果如圖1～3所示。

由試驗(yàn)結(jié)果可知，在擬定的色譜條件下，對(duì)照品溶液和供試品溶液中丹參酮ⅡA和丹酚酸B的峰形良好，無(wú)雜質(zhì)峰干擾，且完全分開，分離度＞1.5，理論塔板數(shù)不少于8 000。結(jié)果表明，該方法系統(tǒng)適應(yīng)性良好，符合試驗(yàn)要求。

圖1 丹參酮ⅡA和丹酚酸B的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液

圖2 供試品溶液

圖3 空白溶劑色譜圖（甲醇溶液）

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn)

取配置好的丹酚酸B和丹參酮ⅡA混合對(duì)照品溶液，按照所述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積。經(jīng)計(jì)算，丹酚酸B峰面積的RSD=0.79%，n=6；丹參酮Ⅱ峰面積的RSD=0.81%，n=6。結(jié)果表明，該儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次回陽(yáng)液6份，依2.2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，并按照色譜條件進(jìn)樣。經(jīng)計(jì)算，同一批回陽(yáng)液供試品溶液中丹酚酸B峰面積的RSD值是1.37%，n=6；丹參酮ⅡA峰面積的RSD值是2.08%，n=6，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)建立的方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

制備好的供試品溶液，常溫放置，分別于0、6、12、24、36、48 h在2.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣。經(jīng)計(jì)算丹酚酸B和丹參酮ⅡA峰面積的RSD值分別是1.89%（n=6）、1.07%（n=6），結(jié)果表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 線性關(guān)系的考察

精密吸取2.2.1配置好的丹酚酸B和丹參酮ⅡA混合對(duì)照品溶液適量，用甲醇稀釋為6份不同濃度的丹酚酸B和丹參酮ⅡA混合對(duì)照品溶液。分別按照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣。以峰面積為縱坐標(biāo)，樣品質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)計(jì)算：丹參酮ⅡA的回歸方程是Y=4×107X-72070，R2=0.999 6，線性范圍是2.65～265 μg/mL；丹酚酸B的回歸方程是Y=1×107X-305 38，R2=0.999 3，線性范圍是1.95～195 μg/mL。結(jié)果表明，此色譜條件下丹酚酸B和丹參酮ⅡA峰面積與濃度之間存在良好的線性關(guān)系。

2.4.5 加樣回收試驗(yàn)

取已測(cè)含量的供試品溶液9份，每份5mL，分成3組，每組分別加2.2.1制成的混合對(duì)照品溶液0.5 mL、1 mL、2 mL，加甲醇定容到10 mL。按照2.2.2方法處理樣品，0.2 un微孔濾膜過(guò)濾后，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積。

經(jīng)計(jì)算，丹參酮ⅡA的平均加樣回收率為99.80 %，RSD%=1.28；丹酚酸B的平均加樣回收率為99.51%，RSD%=2.15%，結(jié)果表明該試驗(yàn)方法加樣回收率良好。

2.5 樣品含量測(cè)定

10批次回陽(yáng)液分別按2.2.2項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液各2份，共計(jì)20份樣品。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。經(jīng)計(jì)算，回陽(yáng)液中丹酚酸B和丹參酮ⅡA的質(zhì)量濃度是（75.16±3.448）μg/mL、（1.299±0.163 0）μg/mL，其95%的可信限分別是72.69～77.63 μg/mL、1.183～1.416 μg/mL。由此，可以建立回陽(yáng)液最低限量的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

3 分析與討論

丹參作為傳統(tǒng)的活血化瘀中藥已經(jīng)長(zhǎng)期且廣泛應(yīng)用于在臨床心腦血管等疾病的治療，療效顯著，不良反應(yīng)小。丹參酮ⅡA具有心臟保護(hù)、擴(kuò)張冠脈、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗凝、抗血栓形成及抑制心肌肥厚作用[6]。丹酚酸B為丹參的有效水溶性成分，具有有抗炎、抗衰老、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗缺血及缺血再灌注損傷等[7]，特別是對(duì)心腦血管疾病的保護(hù)作用和抗纖維化的作用效果明顯，具有良好的臨床應(yīng)用前景。這些藥理作用與復(fù)方中藥回陽(yáng)液回陽(yáng)救逆、改善微循環(huán)、抗休克的功效基本一致。

4 結(jié)語(yǔ)

丹酚酸B是水溶性的、丹參酮ⅡA是脂溶性的，二者極性相差很大，難以使用一種色譜條件將其同時(shí)測(cè)定。本試驗(yàn)建立的反相高效液相色譜法操作簡(jiǎn)便，能夠同時(shí)測(cè)定中藥復(fù)方回陽(yáng)液中丹參酮ⅡA和丹酚酸B的含量，達(dá)到了“一測(cè)多評(píng)”的效果，同時(shí)供試品溶液處理簡(jiǎn)便，溶液穩(wěn)定性好，檢測(cè)方法快捷、準(zhǔn)確、靈敏度高，為建立中藥復(fù)方回陽(yáng)液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。