陳勝發(fā)，顧國強(qiáng)

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100; 2.山東步長神州制藥有限公司，山東 菏澤 274039)

飼料是家畜生長發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ)，飼料中各類養(yǎng)分常常會(huì)受到各種因素的影響會(huì)發(fā)生氧化現(xiàn)象，導(dǎo)致營養(yǎng)價(jià)值降低。家畜采食氧化的飼料后，會(huì)產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)，引起不良癥狀[1]。紅棗為鼠李科棗屬植物(ZizyphusjujubaMill.)的成熟果實(shí)，紅棗中不僅含有極其豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，還具有多糖類、皂甙類、萜酸類、黃酮類、多酚類、腺苷類等多種功能性植化成分[2]，其中多糖是紅棗中重要的生物活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、降血脂、抗病毒、抗氧化、抗?jié)兊茸饔肹3]，現(xiàn)已應(yīng)用在家畜飼料配方中，防霉效果顯著，表現(xiàn)出一定的可行性[4-5]，目前紅棗多糖的研究主要集中在提取工藝的優(yōu)化及藥理活性的研究上，紅棗多糖的理化性質(zhì)及其體外抗氧化活性研究較少[6-8]。本文以紅棗為原料提取紅棗多糖，測定各單糖組成和分子量大小，為進(jìn)一步研究紅棗多糖結(jié)構(gòu)與抗氧化活性的關(guān)系提供理論依據(jù)，同時(shí)也為以紅棗開發(fā)綠色安全的家畜飼料添加劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

紫外分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；2014C氣相色譜儀(FID檢測器)：日本島津公司；JD400-3型電子分析天平：沈陽龍騰電子有限公司。

紅棗藥材購于西安萬壽路藥材市場，甲醇(四川西隴化工有限公司)；DPPH·、ABTS·+、單糖標(biāo)準(zhǔn)品；Sigma公司；硼氫化鈉、正丙胺，阿拉丁試劑公司；DEAE Sepharose Fast Flow，GE公司。

1.2 紅棗多糖(ZSP)提取

取去核紅棗細(xì)粉，無水乙醇脫脂，取脫脂棗粉90 ℃水提，冷卻濃縮離心，上清液加入4倍體積的95%乙醇 4 ℃過夜，4 000 r/min 離心 15 min 得沉淀，即為紅棗多糖[9]。

1.3 紅棗多糖的分離

稱取一定量的紅棗粗多糖(ZSP)，溶于適量蒸餾水中，離心10 min，取上清液上樣。經(jīng)過DEAE-Sepharose Fast Flow柱子，依次用0、0.2、0.3 M的NaCl洗脫，得到3個(gè)紅棗多糖組分：ZSP-1，ZSP-2，ZSP-3。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 糖含量測定 采用苯酚-硫酸法測定總糖含量[10]。

1.4.2 分子量測定 采用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)測定紅棗多糖各組分平均分子量。樣品處理：1 mg樣品溶于1 mL流動(dòng)相，離心(10 000 r/min 15 min)，0.22 μm濾膜過濾后上樣；色譜條件：色譜柱：TSKgel 5 000 PWXL 7.5 mm*30 cm 加保護(hù)柱(TSK gelguard column PWxL)；液相：Waters 1 500 Series HPLC；檢測器：折光示差檢測器(waters 2414)；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：0.2 mol/L NaCl(20 mmol/L pH6.0 磷酸鹽緩沖液)；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.5 mL/min[11]。

1.4.3 單糖組成的測定 采用氣相色譜法測定紅棗多糖各組分的單糖組成。稱取10 mg的粗多糖，用三氟乙酸法進(jìn)行水解、衍生、用二氯甲烷定容、過0.45 μm的濾膜，上機(jī)測定。氣相色譜條件：升溫條件為：180 ℃(2 min)-6 ℃/min，210 ℃(2 min)-0.3 ℃/min，215 ℃(20 min)-6 ℃/min，240 ℃(10 min)，分析時(shí)間60 min，進(jìn)樣口溫度250 ℃。色譜柱為DB-17柱，柱溫180 ℃，F(xiàn)ID溫度250 ℃，進(jìn)樣量1.0 μL[12]。

1.4.4 DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除力測定 參照Dou et al.的方法，用甲醇配制DPPH自由基工作液。分別取1 mL不同濃度(0.5、1、1.5、2、2.5 mg/mL)的樣品溶液，加入1 mL DPPH溶液，避光30 min，在517 nm處測定吸光度Ai，同時(shí)以2 mL甲醇作空白，1 mL DPPH與1 mL甲醇為對照測其吸光度為Aj，并以抗壞血酸作為陽性對照。根據(jù)以下公式求得DPPH清除率。

C=(1-Ai/Aj)×100%。式中:C為DPPH自由基清除率，Ai為試驗(yàn)組吸光度值，Aj為對照組吸光度值[13]。

1.4.5 ABTS(2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)自由基清除力測定 參照李青等[14]的方法提前配置ABTS自由基儲(chǔ)備液。ABTS自由基儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成在734 nm波長下的吸光度為0.70±0.02。分別取不同濃度(0.5、1、1.5、2、2.5 mg/mL)樣品溶液200 μL，加入ABTS稀釋液3 mL，振蕩后避光反應(yīng)6 min，734 nm處測吸光度?？瞻捉M為甲醇，對照組為3 mL ABTS工作液與200 μL甲醇。按公式計(jì)算ABTS自由基清除率，并以抗壞血酸作為陽性對照。

C=(1-A1/A0)×100%

式中:C為ABTS自由基清除率;A1為試驗(yàn)組吸光度值;A0為對照組吸光度值。

1.4.6 抗還原力(FRAP)值測定 參考黃菲等人的方法配制FRAP試劑。取1 mL的樣液與4.5 mL的TPTZ(2,4,6-三吡啶基三嗪)工作液混勻，避光處理30 min后，在593 nm測吸光度。以FeSO4·7H2O為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的抗氧化能力以FeSO4·7H2O含量 (μmol /L ) 表示[15]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 總糖含量

采用苯酚-硫酸法測定糖含量，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=6.725X-0.0314(R2= 0.9991)，紅棗粗多糖(ZSP)中糖含量為37.29%，用DEAE層析柱從ZSP中分離出三個(gè)組分ZSP-1，ZSP-2，ZSP-3, 其糖含量分別為89.34%，64.26%，64.16%。

2.2 平均分子量的測定

本研究采用高效凝膠色譜法測定紅棗多糖的分子量，以葡聚糖為標(biāo)品，其標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Log(Mw)=-0.3259x+10.94(R2=0.9938)。各組分分子量，分別為ZSP 7.69×105Da,ZSP-1 7.28×104Da,ZSP-2 1.29×105Da,ZSP-3 1.70×105Da；與Chang等[16]的研究紅棗多糖分子量(40,570-129,520 Da)相符合。

2.3 單糖組成分析

由表1知，ZSP經(jīng)氣相色譜分析，結(jié)果表明ZSP多糖的單糖組成為半乳糖醛酸、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖，其相對摩爾比是5.40∶2.47∶2.27∶1.57∶1.46∶1.12∶1.00，木糖和半乳糖醛酸含量較高，是一類組成復(fù)雜、結(jié)構(gòu)多樣的雜多糖。

表1 紅棗多糖的單糖組成Table 1 The monosaccharide composition of polysaccharides

ZSP-1是由鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，不含糖醛酸，是中性雜多糖；酸性多糖ZSP-2的單糖組成是：鼠李糖、木糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸，ZSP-2主要由鼠李糖組成，且含有大量糖醛酸，推測其是果膠多糖；ZSP-3的單糖組分為：巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖醛酸，其摩爾比為0.91∶1.45∶4.48∶1∶0.80。ZSP-3則主要由甘露糖組成，含有半乳糖醛酸，屬于酸性多糖。

2.4 抗氧化活性分析

2.4.1 DPPH自由基清除作用 由表2知，ZSP-1，ZSP-2，ZSP-3都有一定的DPPH自由基清除能力，且彼此之間沒有顯著性差異，其DPPH自由基清除力均達(dá)到了30%以上，結(jié)果高于Zhang等[17]的研究，原因可能是熱水浸提法較好的保持多糖的活性。紅棗多糖各組分之間DPPH自由基清除率的順序?yàn)椋篫SP-1>ZSP-3>ZSP-2。

表2 ZSP-1、ZSP-2、ZSP-3對DPPH自由基清除作用Table 2 Scavenging effect of ZSP-1, ZSP-2 and ZSP-3 on DPPH free radicals

2.4.2 ABTS自由基清除作用 由表3知，ZSP-1與ZSP-2，ZSP-3的ABTS自由基清除率之間有顯著性差異，ZSP-2和ZSP-3之間沒有顯著性差異，其中ZSP-1>ZSP-2>ZSP-3。紅棗多糖各組分的ABTS自由基清除率都遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于抗壞血酸。

2.4.3 FRAP值 由表4知，ZSP-1和ZSP-2的FRAP值沒有顯著性差異，分別是84.16 μM和80.38 μM，均小于ZSP-3的FRAP值99.97 μM，三個(gè)組分的FRAP值都遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于抗壞血酸的值。

表4 ZSP-1、ZSP-2、ZSP-3的FRAP值Table 4 The FRAP value of ZSP-1, ZSP-2 and ZSP-3

3 討 論

運(yùn)用紅棗天然提取物制作的紅棗香味劑能在風(fēng)味上滿足動(dòng)物對酸甜的喜好，紅棗香味劑作為抗氧化劑還具有一定防霉效果[5]。目前關(guān)于多糖抗氧化活性影響的研究相對較多，其抗氧化機(jī)制不完全清晰，可以確定多糖的抗氧化性與多糖中的異頭氫(anomerichydrogen)有關(guān)，異頭氫能夠與羥基自由基發(fā)生反應(yīng)[18]。Yang等[19]發(fā)現(xiàn)，將多糖甲基化后，羥基數(shù)量的下降會(huì)導(dǎo)致多糖自由基清除率明顯下降，這進(jìn)一步證明了羥基是影響多糖自由基清除率的重要因素。

多糖的氧化作用的強(qiáng)弱與多糖分子量、單糖組成關(guān)系密切。Lin等[20]研究發(fā)現(xiàn)，涼粉草多糖是含有糖醛酸的雜多糖，分子量為1.45×106Da，主要由半乳糖和葡萄糖組成，對DPPH自由基清除率達(dá)到(55.59±0.69)%。Hu等[21]對藜麥多糖進(jìn)行分離純化得到一個(gè)多糖組分CQP，其分子量較低為8 852 Da，單糖組分主要為半乳糖醛酸和葡萄糖。體外抗氧化研究表明，CQP的DPPH自由基、ABTS自由基清除率的IC50值分別為1.859 mg/mL、1.108 mg/mL。本研究的紅棗粗多糖ZSP的分子量較大為7.69×105Da，含有大量的半乳糖醛酸，羥基的數(shù)量較多，其DPPH自由基、ABTS自由基清除率的IC50值分別為3.73 mg/mL、6.16 mg/mL。

4 結(jié) 論

本研究表明，紅棗多糖的含糖量為37.29%，分離得到ZSP-1、ZSP-2、ZSP-3三種組分，其分子量存在一定的差異性，其中：ZSP-1不含糖醛酸，是中性糖；ZSP-2和ZSP-3是酸性糖。ZSP的單糖組成為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸，ZSP濃度與DPPH、ABTS自由基清除率成線性相關(guān)；ZSP-1、ZSP-2、ZSP-3均具有一定的抗氧化活性。