邱啟官，李 慶，許英蕾

(1.長(zhǎng)沙生態(tài)動(dòng)物園，湖南 長(zhǎng)沙 410119 ; 2.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，浙江 杭州 311300)

我國(guó)是瀕危野生動(dòng)物大國(guó)，野生動(dòng)物不僅是生態(tài)圈的一個(gè)重要部分，同時(shí)也是我們?nèi)祟惖墓餐膶氋F財(cái)富。野生動(dòng)物瀕臨滅絕大致可以分成兩個(gè)因素，第一個(gè)因素是我們?nèi)祟愒诖笞匀恢械牟糠中袨樗l(fā)的直接的或間接地結(jié)果；第二個(gè)因素是野生動(dòng)物自己本身的基因遺傳，疾病等問(wèn)題造成的，在疾病對(duì)野生動(dòng)物的危害中寄生蟲(chóng)危害是其中一個(gè)主要的病因。全國(guó)各地的野生動(dòng)物保護(hù)機(jī)構(gòu)、動(dòng)物園等雖然為野生動(dòng)物的生存提供了一定的保障,但將野生動(dòng)物聚集在一個(gè)固定的區(qū)域里時(shí),這將大大的增加寄生蟲(chóng)感染或交叉感染的機(jī)率。Stephen A.Smith 認(rèn)為不論野生或圈養(yǎng)猛禽都可能從捕食疾病、受傷、或者被捕食等問(wèn)題使得自身或上級(jí)食物鏈直接或間接感染了某種寄生蟲(chóng)致使自身或上級(jí)食物鏈動(dòng)物出現(xiàn)寄生蟲(chóng)病害問(wèn)題。這些研究均表明，野生動(dòng)物及圈養(yǎng)野生動(dòng)物的健康已受到寄生蟲(chóng)的嚴(yán)重威脅[1-3]。如何能夠預(yù)防寄生蟲(chóng)對(duì)野生動(dòng)物的侵襲，尋找一種有效的、準(zhǔn)確的手段快速的檢測(cè)出野生動(dòng)物體內(nèi)的寄生蟲(chóng)，以及對(duì)患有寄生蟲(chóng)的野生動(dòng)物提供一種有效的治療手段，這些問(wèn)題都是當(dāng)代迫切需要解決的問(wèn)題。

蛔蟲(chóng)是寄生在動(dòng)物胃腸內(nèi)的一種大型寄生線蟲(chóng)，嚴(yán)重時(shí)往往引起動(dòng)物腸梗阻死亡或者生長(zhǎng)發(fā)育不良等現(xiàn)象?；紫x(chóng)繁殖力強(qiáng)，10～20萬(wàn)卵/天·蟲(chóng)，每蟲(chóng)一生可產(chǎn)3 000多萬(wàn)個(gè)卵，蟲(chóng)卵對(duì)外界各種因素的抵抗力強(qiáng)，易于發(fā)育成感染性蟲(chóng)卵。因此，環(huán)境是蛔蟲(chóng)普遍感染的重要因素。由于人類活動(dòng)所造成的一系列環(huán)境、生態(tài)等問(wèn)題使蛔蟲(chóng)反復(fù)感染率、人獸共患機(jī)率都有所升高，這對(duì)人類健康、野生動(dòng)物保護(hù)造成了威脅[4-7]。

國(guó)內(nèi)外對(duì)白獅寄生蛔蟲(chóng)研究得很少，獵豹是從非洲引進(jìn)的動(dòng)物，在本地飼養(yǎng)已有5年，由于蛔蟲(chóng)寄生宿主具有特異性，因此研究寄生于這2種野生動(dòng)物的蛔蟲(chóng)，有利于寄生蟲(chóng)疾病的防治[8]。傳統(tǒng)的寄生蟲(chóng)分類有很大局限性，隨著分子生物學(xué)的興起和PCR技術(shù)的成熟，蛔蟲(chóng)的研究可以準(zhǔn)確分類至亞種[9]。而線粒體內(nèi)細(xì)胞色素I(cox1)具有種內(nèi)保守，種間差異大的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于寄生蟲(chóng)的準(zhǔn)確分類研究中[10]。本次樣本均采集自長(zhǎng)沙生態(tài)動(dòng)物園的白獅和獵豹，利用PCR技術(shù)，對(duì)樣品蛔蟲(chóng)進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，并比較來(lái)自2種不同動(dòng)物蛔蟲(chóng)的差異性。

Blouin認(rèn)為，用線粒體DNA內(nèi)的cox1 和nad4基因作為遺傳標(biāo)記來(lái)鑒定蟲(chóng)種，尤其是隱藏種更為有效。李明偉等應(yīng)用PCR-SSCP技術(shù)和 DNA序列分析對(duì)犬弓首蛔蟲(chóng)(Toxocara canis )線粒體DNA (mtDNA) 中的細(xì)胞色素C氧化酶第1亞基(cox1 ) 基因部分序列(pcox1 ) 進(jìn)行了分析研究，并與弓首屬的貓弓首蛔蟲(chóng)、馬來(lái)西亞弓首蛔蟲(chóng)、牛弓首蛔蟲(chóng)及弓蛔屬的獅弓蛔蟲(chóng)進(jìn)行了種間比較[11-12]。結(jié)果表明，不同犬弓首蛔蟲(chóng)地方株的cox1 基因序列有一定差異，顯示較明顯的多態(tài)性；同時(shí)，線粒體基因序列分析的結(jié)果與種特異PCR鑒定結(jié)果一致。

聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析 (PCR-SSCP) 是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的一種用于檢測(cè)DNA突變的分析方法，具有簡(jiǎn)便、快速、敏感、無(wú)假陽(yáng)性、成本低等特點(diǎn)，適用于大量樣本的篩選，是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最常用的基因突變檢測(cè)方法之一[13-14]。本研究應(yīng)用PCR-SSCP方法并結(jié)合DNA序列分析對(duì)弓首蛔蟲(chóng)線粒體DNA內(nèi)的cox1 基因進(jìn)行多態(tài)性研究，以進(jìn)一步明確該屬蟲(chóng)種的分類 。

1 材料與方法

1.1 寄生蟲(chóng)采集 本試驗(yàn)所用蟲(chóng)體樣品均采自長(zhǎng)沙生態(tài)動(dòng)物園。其中包括白獅(編號(hào)：WL1、WL2)和獵豹(編號(hào)：CH1、CH2)兩種動(dòng)物蛔蟲(chóng)成蟲(chóng) 4個(gè)樣本，經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定為蛔蟲(chóng)，70%酒精保存。

1.2 主要試劑 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) DL-2000、TaqDNA 聚合酶，購(gòu)自寶工生物工程(大連)有限公司；蛋白酶 K由天根生物科技(北京)有限公司生產(chǎn)；Wizard DNA Clean-up System為Promega公司產(chǎn)品。

1.3 引物 根據(jù)弓首蛔蟲(chóng)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素I(cox1 )基因序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列為上游引物(JB3) : 5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′(24 bp)，下游引物(JB4.5): 5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′(24 bp)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 DNA提取 從70%酒精中用無(wú)菌鑷子取出單個(gè)蟲(chóng)體，用雙蒸水反復(fù)吹洗6次，每次5 min。用滅菌微型剪刀剪取蟲(chóng)體2 cm大小片段樣品至于1.5 mL的離心管內(nèi)剪碎，加入200 μL GA Buffer 溶液與30 μL蛋白酶K 溶液，反復(fù)震蕩混勻后，置于65 ℃恒溫箱內(nèi)消化2-3 h，每30 mins 混勻1次。消化完全后的蟲(chóng)體懸濁液按照DNA 提取試劑盒使用說(shuō)明書(shū)提取DNA，DNA 樣品分裝后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5Pcox1 基因片段的PCR 擴(kuò)增與鑒定 PCR擴(kuò)增體系為25 μL： 雙蒸水13.25 μL、MgCl(25 mmol/L)4 μL、dNTPs(2.5 mmol/L) 2.5 μL、10×PCR Buffer 2 μL、上、下游引物(50 pmol)各0.5 μL、rTaq(5 U/μl)0.25 mL、模板DNA 2 μL，混勻后短暫離心15 s。同時(shí)，以雙蒸水代替模版DNA 作空白對(duì)照。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；循環(huán)37次，最后72 ℃延伸5 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，并將PCR 陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行純化后送至華大基因生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 2種野生動(dòng)物蛔蟲(chóng)成蟲(chóng)4個(gè)樣品均擴(kuò)增出約415 bp左右的條帶，片段大小也與所擴(kuò)的片段一致，空白對(duì)照也為陰性。詳見(jiàn)圖1。

2.2 序列分析 兩種野生動(dòng)物4個(gè)樣品測(cè)序得到的Pcox1序列，與GenBankTM收錄JF780951.1(獅弓蛔蟲(chóng))序列用Blast軟件比較，WL1與 JF780951.1比較3處堿基置換，1處堿基顛換序列差異1.0%；WL2與JF780951.1比較無(wú)序列差異，序列差異為0；CH1與 JF780951.1比較2處堿基置換，1處堿基缺失，序列差異1.0%；CH2與JF780951.1比較2處堿基置換，2處堿基缺失，序列差異 1.0%。

圖1 弓首蛔蟲(chóng)pcox1 序列PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2.1pcox1 基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用 DNAStar 5.0的MegAlign軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，在長(zhǎng)沙生態(tài)動(dòng)物園分離到的2種野生動(dòng)物蛔蟲(chóng)4個(gè)樣品中，獵豹蛔蟲(chóng)(CH1、CH2)位于獨(dú)立分支上，白獅蛔蟲(chóng)(WL1、WL2)與獵豹蛔蟲(chóng)(CH1、CH2)位于同一分支上，四個(gè)樣品處在同一個(gè)獨(dú)立分支上；獵豹蛔蟲(chóng)(CH1、CH2)和白獅蛔蟲(chóng)(WL1、WL2)與 GenBank 登錄號(hào) JF780951.1(獅弓蛔蟲(chóng))位于同一大分支上；獵豹蛔蟲(chóng)、白獅蛔蟲(chóng)、JF780951.1(獅弓蛔蟲(chóng))與 GenBank 登錄號(hào) AB446546.1：貍貓弓首蛔蟲(chóng)；JF780942.1：貓弓首蛔蟲(chóng)；JF780951.1：獅弓蛔蟲(chóng)；KC293913.1：犬弓首蛔蟲(chóng)；KC998824.1：豬蛔蟲(chóng)位于不同的大分支上。

圖2 蛔蟲(chóng)Pcox1序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

AB446546.1：貍貓弓蛔蟲(chóng)； JF780942.1：貓弓首蛔蟲(chóng)； JF780951.1：獅弓蛔蟲(chóng)； KC293913.1：犬弓蛔蟲(chóng)； KC998824.1：豬蛔蟲(chóng)

2.2.2pcox1基因序列同源性分析 利用 DNAStar 5.0 的 MegAlign 軟件同源性分析顯示，白獅蛔蟲(chóng)(WL1、WL2)序列差異達(dá) 4.2%；獵豹蛔蟲(chóng)(CH1、CH2)序列差異 0.7%；獵豹蛔蟲(chóng)(CH1、CH2)與白獅蛔蟲(chóng)(WL1、WL2)序列平均差異 3.6757%，且與 GenBankTM收錄登錄號(hào) JF780951.1(獅弓蛔蟲(chóng))比較：白獅蛔蟲(chóng)(WL1、WL2)序列平均差異4.05%，獵豹蛔蟲(chóng)(CH1、CH2)序列平均差異 2.5%；與 GenBankTM登錄號(hào) AB446546.1：貍貓弓蛔蟲(chóng)；JF780942.1：貓弓首蛔蟲(chóng)；KC293913.1：犬弓手蛔蟲(chóng)；KC998824.1：豬蛔蟲(chóng)序列相比差異均超過(guò)10.1%以上。

圖3 線粒體DNA pcox1 基因片段的相似性和差異性(%)

注：Line1-9: CH2，CH1，WL2，WL1，AB446546.1(貍貓弓蛔蟲(chóng)), JF780942.1(貓弓首蛔蟲(chóng)), JF780951.1(獅弓蛔蟲(chóng)), KC293913.1(犬弓手蛔蟲(chóng)), KC998824.1(豬蛔蟲(chóng))

3 討論

本研究對(duì)湖南省長(zhǎng)沙生態(tài)動(dòng)物園2種野生動(dòng)物4個(gè)蛔蟲(chóng)樣品的Pcox1 基因序列進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，與 GenBank 收錄 JF780951.1(獅弓蛔蟲(chóng))序列用 Blast 軟件比較，主要極少數(shù)的堿基置換、顛換、缺失及無(wú)差異，白獅蛔蟲(chóng)WL1、WL2 與 JF780951.1 基因序列差異 0～1.0%；獵豹蛔蟲(chóng) CH1、CH2 與JF780951.1 基因序列差異 1.0%；利用 DNAStar 5.0 的 MegAlign 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，白獅蛔蟲(chóng) WL1、WL2 和獵豹蛔蟲(chóng) CH1、CH2 位于同一分枝上，并與JF780951.1(獅弓蛔蟲(chóng))最近，與其他序列相差較遠(yuǎn)；利用 DNAStar 5.0 的 MegAlign軟件差異性比較，GenBankTM收錄登錄號(hào) JF780951.1(獅弓蛔蟲(chóng))與白獅蛔蟲(chóng)(WL1、WL2)基因序列平均差異 4.05%，與獵豹蛔蟲(chóng)(CH1、CH2)基因序列平均差異為 2.5%，與其他序列相比差異均在 10.1%以上。因此，這來(lái)自于兩種動(dòng)物的4個(gè)蛔蟲(chóng)樣品均為獅弓蛔蟲(chóng)。

線粒體DNA (mtDNA)基因組缺乏細(xì)胞核基因組中的保護(hù)機(jī)制，變異較為明顯，能夠反映較短時(shí)間內(nèi)的進(jìn)化事件，被廣泛應(yīng)用于物種及種下關(guān)系的鑒別[15]。 本研究結(jié)果揭示mtDNA 中的Pcox1 序列可作為遺傳標(biāo)記鑒定蛔蟲(chóng)蟲(chóng)種，對(duì)今后野生動(dòng)物寄生蟲(chóng)病的蟲(chóng)種分子鑒定、群體遺傳、系統(tǒng)進(jìn)化研究和流行病學(xué)調(diào)查具有一定的指導(dǎo)意義。