馮培祥，楊 莉，趙付偉，姜桂苗，高維平，嵇傳良

(1. 國家膠類中藥工程技術研究中心，山東 東阿 252201；2.東阿阿膠股份有限公司，山東 東阿 252201)

沙門菌(Salmonella)屬腸道菌科，是一群形態(tài)、培養(yǎng)、生化反應和抗原構造相類似的重要腸道菌。其已確認的血清型超過2 500種[1]。沙門菌病是具有重要公共衛(wèi)生學意義的人獸共患病病原菌。Mcllory[2]等報告，日、美等發(fā)達國家發(fā)生食物中毒的事件中40%～80%是由禽沙門菌引起的，其中主要病原為腸炎沙門菌。佘容[3]等報道，沙門菌極易通過直接或間接途徑在人和動物之間傳播，無中間宿主。人畜感染沙門菌后可呈無癥狀帶菌狀態(tài)，降低動物繁殖力，或加重病情及死亡率，也可表現(xiàn)為有臨床癥狀的致死性疾病，造成巨大的經濟損失，嚴重威脅人的身體健康和畜牧業(yè)的健康發(fā)展。其來源主要是患病的人和動物及帶菌者通過糞便、尿、乳汁及流產胎兒、胎衣和羊水等排出，污染水源、土壤和飼料等[3]。本病常發(fā)生于豬、雞、牛等動物，而關于馬屬動物特別是驢的沙門菌病國內報道很少。劉建國等[4]報道從一頭死亡驢的肝、脾、淋巴結中分離到沙門菌，確定其是驢死亡原因。作者通過檢測一例流產驢駒胎兒組織，并從中分離并鑒定出沙門菌，確定其是引起流產的致病菌。之后對其進行了藥敏試驗，藥敏試驗結果為該病在臨床上的用藥選擇提供了依據，也為驢上沙門菌病的診斷與預防提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 2017年7月份，聊城某養(yǎng)驢廠母驢出現(xiàn)流產現(xiàn)象，采集一頭流產胎兒，對其進行剖檢，采集了心、肝、脾、肺、腎等臟器。將采集的樣品保存于4 ℃環(huán)境中，在12 h 內進行細菌分離培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基 pMD19-T載體、dNTP、TaqDNA 聚合酶、瓊脂糖、DL-2 000 DNA Marker、凝膠回收試劑盒、DNA提取試劑盒，均購自寶生物工程(大連)有限公司。普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、S.S.培養(yǎng)基、XLD培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術有限公司。

1.1.3 藥物 復方新諾明、諾氟沙星、慶大霉素、青霉素、丁胺卡那霉素、氯霉素、紅霉素、強力霉素、氧氟沙星、四環(huán)素、潔霉素C、多黏菌素B、環(huán)丙沙星等藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.4 主要設備 賽默PCR基因擴增儀(2720)、山東鑫科生物科技股份有限公司自動生化/藥敏分析儀(XK型)、北京君意垂直電泳儀(JY300C)。上海一恒恒溫振蕩器(THZ98A)、湖南湘儀冷凍離心機(H1850R)、山東鑫科比濁儀(XK型)。

1.2 方法

1.2.1 病原的分離及特性培養(yǎng) 無菌采集剖檢流產驢駒的肝臟、脾臟和肺臟、心臟及腎臟，通過三區(qū)劃線將上述臟器分別接種普通瓊脂平板、S.S.瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基平板，每一種臟器分別接種2份平板，1份進行需氧培養(yǎng)，1份進行厭氧培養(yǎng)。置于 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24～48 h 后觀察平板有無菌落形態(tài)并進行革蘭染色鏡檢。參考文獻[5]方法檢測病變器官是否有病毒感染，將上述病變器官稱重、研磨。按1∶5(W/V)比例加入PBS制成懸液，加入雙抗1 500 IU(μg)/mL，反復凍融 3～4次，離心取上清液并過濾接種至犢牛睪丸細胞，37 ℃培養(yǎng)，觀察細胞病變，并將細胞染色后于電鏡下觀察。

1.2.2 分離菌生化鑒定 按照山東鑫科生化鑒定試劑盒說明書進行操作，上機通過其自動生化儀(XK型)進行鑒定，通過生化儀自動判讀結果。

1.2.3 藥敏試驗 參照CLSL(Clinical and Laboratory Standards Institute)推薦的K-B紙片擴散法進行藥敏試驗[6]，參照趙戰(zhàn)鋒[7]等的方法，將分離純化的2株細菌，接種于普通LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。超凈臺內用無菌生理鹽水稀釋菌液，通過比濁儀將菌液稀釋成0.5麥氏標準的菌懸液，吸取200 μL菌液于MH培養(yǎng)基平板內，在其表面涂布均勻，蓋上平板，于37 ℃放置5 min，然后取回在超凈臺內，用無菌小鑷子夾取各種藥敏紙片，平貼于瓊脂表面，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，平板取出后，觀察藥敏紙片周圍有無抑菌圈形成，測量其直徑(mm)大小。每株細菌的藥敏試驗設置一個重復。參考羅玲[8]等報道方法進行結果判定： 直徑>15 mm 為高度敏感；10.1 mm<直徑≤15 mm為中度敏感；直徑≤10 mm 為耐藥。

1.2.4 16S rRNA基因序列測定與系統(tǒng)進化分析 將2株分離菌接種于普通LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，采用苯酚-氯仿法抽提分離菌株基因組DNA。自行設計16S rRNA上游引物F：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，下游引物R：5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′。PCR反應體系為30 μL，即ddH2O 19 μL、10×Buffee 5 μL、dNTP Mix 2.5 μL、Taq酶 0.5 μL、上下游引物各0.5 μL(引物濃度為40 pmmol/μL)、DNA模板2 μL。PCR反應條件為94 ℃ 預變性 5 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃ 退火 40 s，72 ℃ 延伸 60 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 終延伸 8 min。擴增產物結束后，PCR 產物用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢查結果，并用膠回收試劑盒回收純化 PCR 產物。純化的目的片段與 pMD19-T 載體相連，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，經 PCR 鑒定后，將陽性重組質粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序并命名為A1、A2。

將上述2株分離菌的16S rRNA 基因序列通過NCBI的Blast 檢索系統(tǒng)進行序列的同源性分析，使用軟件從GenBank 數據庫中獲得的沙門菌的16S rRNA 序列進行多序列匹配排列(Multiple Alignments)，采用鄰接法(Neighbor joining method)構建分支系統(tǒng)樹。

2 結果

2.1 分離菌培養(yǎng)特征及形態(tài)觀察 分別從流產驢駒肝、肺內分離到2株細菌，分別命名為A1、A2，未分離到其他細菌。該分離菌在普通營養(yǎng)瓊脂平板上菌落邊緣整齊，表面光滑，半透明。小凸起。在S.S.培養(yǎng)基上呈無色透明，菌落中心有黑色圓點。其在麥康凱培養(yǎng)基上長出表面光滑、半透明的圓形菌落。2株分離菌革蘭染色為陰性，桿狀，無芽孢，無莢膜，有鞭毛。散在或個別成排排列，菌體體積大小約為0.6～1.0×2～3 μm。

病變肝肺組織研磨懸浮上清液接種于犢牛睪丸細胞后，未出現(xiàn)病變，鏡檢也未發(fā)現(xiàn)病毒顆粒。

2.2 分離菌生化反應結果 將2株分離株于LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫搖床培養(yǎng)24 h 后，于超凈臺內用滅菌生理鹽水將菌液稀釋至0.5麥氏比濁濃度，按照山東鑫科生物科技股份有限公司細菌生化鑒定測試試劑盒(XK-24A-C)說明書進行操作，2株分離菌生化反應結果一致，均符合沙門菌生化特性。結果見表1。

2.3 藥敏試驗結果 對2株分離菌的抑菌圈大小進行測量，結果顯示，2株分離菌的藥物敏感性基本一致，取其平均值，結果見表2。

表1 分離菌株的生化鑒定結果

“+”陽性反應，“-”為陰性反應

表2 2株分離株的藥物敏感性(平均值)

R 耐藥；I 中度敏感；S 敏感

2.4 16S rRNA基因序列測定與系統(tǒng)進化分析 提取2株分離菌的DNA后，對其16S rRNA進行擴增，在1 500 bp處有目的條帶，與預期擴增結果相一致(圖1)。 測序結果顯示，2株分離菌的16S rRNA基因序列長度均為1 560 bp，將2株分離菌16S rRNA基因序列與GenBank 核算數據庫進行同源性檢索，其結果與沙門菌的16S rRNA 基因自然聚類，將分離株分別與 GenBank收錄的沙門菌通過DNAStar進行同源性分析，并繪制成系統(tǒng)進化樹(圖2)。結果顯示，2株分離株核苷酸序列之間的同源性為98.6%，與GenBank收錄的其他腸炎沙門菌EU073020.1、MF521947、MF682400同源性分別為99.4%、99.3%、97.7%。與GenBank收錄的霍亂沙門菌DQ344535、NZ_MYYB01000065、NZ_MYYT01000080同源性分別為99.6%、96.3%、44.5%。與GenBank收錄的傷寒沙門菌AB855736、JQ284055.1、KX232359、MG270582同源性分別為97.3%、96.9%、89.4%、98.1%。與GenBank收錄的鼠傷寒沙門菌JN254642、KY750226同源性分別為96.9%、95.9%。與GenBank收錄的亞利桑那沙門菌AB273736、KX082838、NR_116125同源性分別為97.5%、97.4%、98.1%。系統(tǒng)發(fā)育樹結果顯示，2株分離菌處于同一分支，且與霍亂沙門菌DQ344535最近、與腸炎沙門菌MF521947、EU073020.1遺傳距離較傷寒沙門菌、鼠傷寒沙門菌的其他分離株遺傳關系較遠。

圖1 2株分離菌16S rRNA目的基因的PCR結果

1：陰性對照； 2：A1； 3：A2； M：DL-2 000 Marker

圖22株分離菌16SrRNA基因序列的同源性

圖3分離菌16SrRNA基因系統(tǒng)進化樹

3 討論

本試驗從流產驢駒的肝臟與肺臟分離到2株革蘭陰性桿菌，經生化鑒定為沙門菌，將所得菌株的16S rRNA基因序列在NCBI上用Blast 進行同源性比較，分離株與霍亂沙門菌的同源性最高為99.6%。除了傳統(tǒng)的分離鑒定及生化鑒定以外，本試驗選取了保守的16S rRNA基因并結合基因測序手段實現(xiàn)了沙門菌的診斷。16S rRNA基因為細菌高度保守基因，具有細菌種、屬特征，已被用作細菌系統(tǒng)發(fā)育分類的目的基因，是一種對細菌分類鑒定快速、準確的方法[9]。據報道[10-11]沙門菌可以引起妊娠并發(fā)癥，比如絨毛膜羊膜炎、經胎盤的胎兒感染、早產、流產、新生兒和產婦敗血癥。據Noto[12]等報道，低劑量的腸炎沙門菌可以導致懷孕后期鼠模型母體感染，導致40%早產和33%流產以及胎兒的生長緩慢。

沙門菌分離鑒定及藥敏試驗在豬、雞、鴨上等報道較多[13-14]。在馬屬動物特別是驢上報道較少。加春生[12]等報道，其從豬糞便中分離出的沙門菌對氨芐西林100%耐藥；對頭孢西丁哌拉西林、頭孢噻肟等藥物存在不同程度的耐藥；對碳青霉烯類敏感。王傲雪[13]等報道的其對26株沙門菌進行分離鑒定后，對5株強陽性菌株進行藥敏試驗，藥敏試驗結果顯示，5株沙門菌對頭孢噻肟較為敏感。對氨芐西林、替米考星、林可霉素、阿奇霉素和頭孢拉定表現(xiàn)極高的耐藥性，耐藥率達100%。吳新明[15]等報道的其分離鑒定38株鴨源沙門菌對21種抗生素均有不同程度的耐藥，并以多重耐藥為主，耐藥性差異大，最為敏感的抗生素是磷霉素和阿米卡星兩種藥物。通過上述報道可見，沙門菌在豬、雞、鴨上均出現(xiàn)不同程度的耐藥性，提示上述動物在規(guī)模化養(yǎng)殖過程中，在獸藥廣泛的使用的同時，耐藥菌株也隨之出現(xiàn)。本試驗中2株沙門菌分離株對大部分藥物具有敏感性，尤其對喹諾酮類藥物(氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星)、復方新諾明敏感；對慶大霉素、丁胺卡那霉素、多黏菌素中敏；對青霉素、頭孢氨芐、紅霉素、克林霉素有耐藥性。推測可能在馬屬動物特別在驢上傳染病與臨床用藥較少，故分離株對大多數藥物敏感。由于驢的繁殖周期較長和用驢作為實驗動物成本較高、試驗周期較長等原因，本試驗的不足之處在于未進行分離株回歸本源動物試驗。