唐曉清， 劉 諭， 楊 睿， 李林華， 王 雨， 施晟璐， 王康才

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥研究所，江蘇南京 210095； 2.南京市第九中學(xué)，江蘇南京 210018； 3.安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，安徽蕪湖 241003)

水飛薊[Silybummarinum(L.) Gaertn]為菊科水飛薊屬植物，以其成熟的果實入藥[1]，具有清熱解毒、疏肝利膽的功效，主要用于肝膽濕熱、脅痛、黃疸等癥。其果實中主要含有水飛薊賓、脫氫水飛薊賓、水飛薊寧、水飛薊亭、水飛薊賓聚合物等水飛薊素類化合物[2]，其莖葉含有黃酮類、氨基酸、生物堿等多種化合物[3]。現(xiàn)代藥理研究證明，水飛薊素與水飛薊提取物具有穩(wěn)定和保護(hù)肝細(xì)胞膜、改善肝功能、阻止肝損害、提高免疫力、抗皰疹病毒等功能[4-6]。水飛薊原產(chǎn)于印度和巴基斯坦的喀什米爾山區(qū)，之后在歐洲、美洲及澳洲等多個地區(qū)都有種植[7]。1952年，北京植物園從英國引進(jìn)水飛薊，作為觀賞植物栽培；1972年，由我國土產(chǎn)畜產(chǎn)進(jìn)出口公司天津土產(chǎn)分公司從德國引種作為藥用植物栽培[8]。我國很多地方都已引種成功，目前主要在西北和華北栽培。隨著國內(nèi)制藥企業(yè)對水飛薊原藥材需求的增加，近幾年價格也有所上升。水飛薊耐嚴(yán)寒、耐鹽堿、耐旱能力非常強，所以其對土壤要求并不嚴(yán)格，可利用鹽堿地種植。我國的鹽堿土面積較大，研究水飛薊等耐鹽植物對NaCl脅迫的響應(yīng)，對利用大面積鹽堿地資源，對農(nóng)業(yè)鹽漬土的治理、開發(fā)以及提高植物的耐鹽性等方面都有非常重要的意義[9-12]。而目前在其栽培生產(chǎn)中，對其栽培生理與活性成分的研究較少，有研究表明水飛薊種子萌發(fā)期，鹽分主要通過改變種子吸漲能力來影響芽苗生長[13]；在苗期，水飛薊幼苗主要通過提高滲透物質(zhì)含量和保護(hù)酶活性來緩解鹽分造成的傷害；水飛薊萌發(fā)期和苗期耐鹽性有差異，萌發(fā)期耐鹽能力明顯低于苗期；而0.05～0.60 mmol/L的硝普鈉(sodium nitroprusside，簡稱SNP)浸種能提高水飛薊種子和幼苗的抗鹽能力[14]；NaCl溶液濃度在50～400 mmol/L范圍內(nèi)水飛薊素含量隨著鹽濃度的升高有所增加[15]。而NaCl脅迫處理時間對苗期水飛薊生長及活性成分的影響則未見報道。為此以苗期水飛薊為試驗材料，采用水培方式，以 100 mmol/L NaCl溶液處理不同時間，研究NaCl脅迫不同時間對苗期水飛薊生理與活性成分含量的影響，為水飛薊栽培生產(chǎn)中的耐鹽性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為安徽省丫山野生藥用植物園栽培種，經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)王康才教授鑒定為菊科植物水飛薊[Silybummarinum(L.) Gaertn]的種子。

1.2 試驗設(shè)計

于2016年1月24日將水飛薊種子播種于周轉(zhuǎn)箱內(nèi)(基質(zhì)為石英砂 ∶蛭石體積比=1 ∶2)，3月24日選取長勢基本一致的幼苗，單株移植于水培箱(45 cm×50 cm×15 cm)內(nèi)，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，用Hoagland營養(yǎng)液水培，培養(yǎng)期間每2 d換1次營養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為3 000 lx光照、25 ℃、通氣；培養(yǎng)10 d后，進(jìn)行NaCl脅迫處理，將營養(yǎng)液更換為100 mmol/L NaCl溶液，處理時間分別為0、1、2、3、4、5 d，分別記為CK、T1、T2、T3、T4、T5，每個處理8株，3次重復(fù)。

1.3 測定指標(biāo)與方法

全部處理結(jié)束后測定其葉片的葉綠素相對含量SPAD(soil and plant analyzer develotrnent)值，另取新鮮葉片用于可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，簡稱SOD)活性、過氧化物酶(peroxidase，簡稱POD)與過氧化氫酶(catalase，簡稱CAT)活性、丙二醛含量(malondialdehyde，簡稱MDA)的測定，另取6株水飛薊的地上部(葉片)于105 ℃烘箱內(nèi)殺青15 min后，于60 ℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎過80目篩，用于測定可溶性糖、水飛薊素、總黃酮等含量。

1.3.1 葉片葉綠素SPAD值測定 100 mmol/L NaCl脅迫處理結(jié)束后的上午，取由內(nèi)至外全展且無破損的第2輪葉片的中上部作為測定部位，用SPAD 502葉綠素測定儀測定其SPAD值，每個處理測定8株。

1.3.2 葉片中可溶性蛋白含量測定 采用南京建成生物工程所試劑盒(A045-2)進(jìn)行測定。

1.3.3 葉片中抗氧化酶活性的測定 (1)SOD活性的測定：采用南京建成生物工程研究所試劑盒(A001-1)測定；(2)POD活性的測定：采用南京建成生物工程研究所試劑盒(A084-3)測定。利用POD催化H2O2反應(yīng)的原理，通過測定420 nm處吸光度的變化測定其活性。(3)CAT活性的測定：采用南京建成生物工程所試劑盒(A007-1)進(jìn)行測定。利用CAT分解H2O2的反應(yīng)可通過加入鉬酸銨而迅速中止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物，在 405 nm 處測定其變化量，計算CAT活性。

1.3.4 葉片中MDA含量測定 采用南京建成生物工程所試劑盒(A003-1)進(jìn)行測定。

1.3.5 葉片中可溶性糖含量測定 采用苯酚-硫酸法進(jìn)行測定。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取105 ℃干燥到恒質(zhì)量的葡萄糖0.100 0 g，溶解定容于100 mL容量瓶中，得1 mg/mL葡萄糖對照品，精確吸取10 mL，再定容至100 mL，得 100 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液備用。精確量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、1.0、1.5 mL置于干燥試管中，加水使總?cè)芤簽?.0 mL，加入6%苯酚1 mL，再加入濃硫酸5 mL，搖勻，冷卻至室溫，在490 nm下測定吸光度，以葡萄糖溶液含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.012 2X-0.003 7，r2=0.999 5(n=3)。可溶性糖的提?。壕芊Q取 0.200 0 g 水飛薊葉片粉末，置于3支試管中，加入6 mL蒸餾水，塑料薄膜封口，沸水浴提取60 min后，6 000 r/min處理 20 min 取上清液于25 mL容量瓶中，再次加入6 mL蒸餾水沸水浴提取60 min，過濾后至容量瓶中定容。測定：吸取 0.2 mL 樣品液于試管中，加蒸餾水1.5 mL，加入1 mL 6%苯酚、5 mL濃H2SO4，搖勻后靜置冷卻，在490 nm下測定吸光度。

1.3.6 葉片中總黃酮含量測定 精密稱取0.100 0 g水飛薊葉片粉末，加入8 mL 70%乙醇，超聲1 h后過濾，用乙醇定容至25 mL，混勻。取2 mL于試管中，加入0.5 mL 50 g/L NaNO2溶液0.5 mL，搖勻后靜置6 min，加入0.5 mL 100 g/L Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min，加入4 mL 40 g/L NaOH溶液，搖勻，用70%乙醇定容至10 mL，搖勻，靜置15 min，在 510 nm 波長下比色，測定吸光度。以蕓香苷為對照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.010 4X+0.001 0，r2=0.999 5(n=3)。

1.3.7 葉片中水飛薊素含量測定 參考文獻(xiàn)[1]的方法提取水飛薊素。(1)色譜條件為色譜柱：Dubhe C18(250 mm×2.4 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水-冰醋酸體積比= 48 ∶52 ∶1；流速：1.000 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長 287 nm。(2)標(biāo)品溶液制備：精密稱取水飛薊賓標(biāo)品3 mg，加甲醇制成每1 mL含0.12 mg的溶液作為母液，該母液濃度為60 μg/mL，再取適量稀釋成濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、30.0 μg/mL的溶液。經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液即為HPLC法測定用標(biāo)準(zhǔn)品溶液。(3)水飛薊賓標(biāo)準(zhǔn)曲線：取濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、30.0、60.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按10 μL進(jìn)樣量注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積和為縱坐標(biāo)，水飛薊賓的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=15 697.0X-4 702.6，r2=0.999 8(n=3)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)用Excel 2003和SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理，處理間差異顯著性比較采用Duncan氏新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫對苗期水飛薊葉片葉綠素含量的影響

圖1顯示，隨著NaCl脅迫時間的延長，水飛薊葉片中葉綠素含量基本呈現(xiàn)降低趨勢，由CK的42.04 SPAD降至脅迫處理T5的34.58 SPAD，其間NaCl脅迫處理T2到T3時，葉綠素含量由40.07 SPAD略微上升至41.05 SPAD，但是二者間不存在顯著性差異(P>0.05)。與CK比較，NaCl脅迫處理T1、T2、T3的葉綠素含量與CK間無顯著性差異(P>0.05)，而NaCl脅迫處理T4、T5的葉綠素含量顯著低于CK(P<0.05)，但葉綠素含量總體降幅較小。表明，隨著NaCl脅迫處理時間的延長，水飛薊葉片葉綠素的合成受到一定程度的抑制。

2.2 NaCl脅迫對苗期水飛薊葉片抗氧化酶活性和MDA含量的影響

2.2.1 NaCl脅迫對抗氧化酶活性的影響 由圖2可知，在100 mmol/L NaCl脅迫下，苗期水飛薊葉片中的SOD、POD、CAT活性變化基本一致，呈現(xiàn)升高-降低-升高-降低的趨勢，T1處理下SOD、POD、CAT活性顯著高于CK(P<0.05)，說明NaCl脅迫1 d后水飛薊體內(nèi)的抗氧化酶已經(jīng)開始發(fā)揮抗逆作用，以減輕NaCl脅迫對其的傷害。其中CAT在脅迫處理T1時活性達(dá)到最大值43.69 U/mg，比CK顯著增加 61.87%，可見CAT對NaCl脅迫反應(yīng)在三者中最敏感；脅迫處理T2時POD、CAT降低至各處理間的最低水平，其中CAT活性顯著低于對照(P<0.05)，說明3種抗氧化酶在清除活性氧后，水飛薊植株恢復(fù)到了較好的生理水平，抗氧化酶活性降低。在NaCl脅迫處理T3、T4時，SOD、POD、CAT活性繼續(xù)升高，說明持續(xù)的鹽脅迫刺激下，SOD、POD、CAT繼續(xù)發(fā)揮作用，以緩解鹽脅迫對其的傷害。其中T4處理時，SOD與POD的活性最高，分別為30.44、21.02 U/mg，顯著高于相應(yīng)CK處理(P<0.05)，此時的CAT與對照間無顯著差異(P>0.05)。脅迫處理T5時3種酶活性均低于處理T4時的活性，說明持續(xù)較長時間的鹽脅迫后，葉內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)可能受到一定的破壞。

2.2.2 NaCl脅迫對MDA含量的影響 由圖3可知，在 100 mmol/L NaCl脅迫下，苗期水飛薊葉片中MDA含量表現(xiàn)為降低-升高-降低的趨勢，與CK相比NaCl脅迫處理T1、T2、T3的MDA含量顯著下降(P<0.05)，其中T2、T3間無顯著性差異，T2處理的含量(3.61 nmol/mg)最低，脅迫處理T4時MDA含量有所增加，但仍顯著低于CK(P<0.05)，NaCl脅迫處理T5時MDA含量再次顯著低于CK(P<0.05)。說明苗期水飛薊在100 mmol/L NaCl脅迫下前期通過降低MDA含量以應(yīng)對脅迫的傷害，3～4 d后傷害有所緩解其含量開始升高，但隨著脅迫時間的延長，水飛薊須要再次通過降低MDA含量以應(yīng)對持續(xù)的鹽脅迫傷害。

2.3.1 NaCl脅迫對可溶性蛋白含量的影響 圖4結(jié)果顯示，NaCl脅迫處理不同時間后水飛薊葉片中可溶性蛋白含量呈現(xiàn)降低-升高-降低-升高的趨勢，其中脅迫處理T2、T3時可溶性蛋白含量高于CK，處理T2時的含量(61.15 mg/g)最高，比CK顯著增加20.20%(P<0.05)，處理T3時的可溶性蛋白含量與CK間無顯著性差異(P>0.05)，處理T1、T4、T5時的含量均顯著低于對照(P<0.05)。

2.3.2 NaCl脅迫對可溶性糖含量的影響 由圖4可知，水飛薊葉片中可溶性糖含量隨著NaCl脅迫時間的延長呈現(xiàn)降低-升高-降低-升高的趨勢，不同時間脅迫后的各處理均顯著低于CK(P<0.05)，其中脅迫處理T2時的含量(48.71 mg/g)最低。由此推測，一定濃度的NaCl脅迫不同時間后其體內(nèi)可能須要分解可溶性糖以緩解鹽脅迫的傷害。

2.4 NaCl脅迫對苗期水飛薊葉片總黃酮含量的影響

由圖5可知，隨著100 mmol/L NaCl脅迫處理時間的增加，水飛薊葉片中總黃酮含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，其中脅迫處理T2時總黃酮含量最低(3.11%)，且與CK無顯著性差異(P>0.05)；在NaCl脅迫處理T3、T4、T5時，總黃酮含量逐漸上升，且均顯著高于CK的總黃酮含量(P<0.05)，脅迫處理T5的總黃酮含量(7.44%)最大。表明鹽脅迫處理一段時間有利于苗期水飛薊葉片中總黃酮的積累。

2.5 NaCl脅迫對苗期水飛薊葉片中水飛薊賓含量的影響

由圖6可知，100 mmol/L NaCl脅迫處理苗期水飛薊不同時間后，葉片中水飛薊賓含量呈現(xiàn)先降低再升高的趨勢，但均顯著低于CK(P<0.05)。在NaCl脅迫處理T1、T2、T3時，葉片中水飛薊賓含量顯著低于對照CK(P<0.05)，在NaCl脅迫處理T4時，水飛薊賓含量開始略微上升，在NaCl脅迫處理T5時，水飛薊賓含量升高幅度較大(T5高出T4處理45.46%)，且T5處理顯著高于T1～T4處理(P<0.05)?？梢?，一定時間的NaCl脅迫處理不利于苗期水飛薊葉片中水飛薊賓的積累。

3 結(jié)論與討論

3.1 NaCl脅迫下苗期水飛薊抗氧化酶活性和MDA含量的響應(yīng)特征

活性氧是指極為活潑、氧化能力很強的含氧物的總稱。NaCl脅迫下，植物細(xì)胞內(nèi)的活性氧產(chǎn)生和清除不平衡，大量活性氧會積累在植物體內(nèi)，活性氧增多會引起膜脂過氧化、蛋白質(zhì)變性、核酸降解等不良反應(yīng)。膜質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物是MDA，MDA可以作為膜質(zhì)過氧化的一個指標(biāo)[16]。在NaCl脅迫下，SOD、POD、CAT 3種酶的協(xié)同作用能降低氧自由基的積累，阻遏O2-和H2O2通過Fenton型Haber-Weiss反應(yīng)轉(zhuǎn)化成破壞性強的·OH，減輕了自由基對生物大分子的降解破壞，也減輕了其對生物膜的損害[17]，以緩解植物因脅迫受到的傷害。

本研究中，在NaCl脅迫下，SOD、POD和CAT均能積極響應(yīng)，在NaCl脅迫處理T1時，SOD、POD和CAT活性均增加，3種酶對NaCl脅迫反應(yīng)較迅速，能夠快速增大活性來抵御鹽脅迫對自身的傷害；在脅迫處理T2時酶活性降低，3種抗氧化酶清除了大部分的活性氧，說明生長代謝基本恢復(fù)正常；在脅迫處理T3時，3種酶活性又開始增加，持續(xù)的鹽脅迫下3種酶再次被激活，活性增強，從而使葉片細(xì)胞代謝保持在正常水平。而脅迫處理T5時，3種酶活性減小的原因可能是在較長時間的NaCl脅迫下，3種酶的調(diào)節(jié)能力有限，產(chǎn)生活性氧的速度大于這3種酶清除活性氧的速度，導(dǎo)致活性氧迅速破壞生物大分子，使酶活性降低。

隨著鹽脅迫時間的延長，作為膜質(zhì)氧化產(chǎn)物的MDA，其含量與SOD、POD、CAT活性變化的趨勢前期是相反的，說明在NaCl脅迫初期SOD、POD和CAT大量地清除活性氧，MDA含量降低，NaCl脅迫后期SOD、POD和CAT的活性受到限制，清除活性氧的能力降低，活性氧增多，這可能是導(dǎo)致NaCl脅迫4 d后MDA含量升高的原因。

3.2 NaCl脅迫下苗期水飛薊滲透性物質(zhì)的響應(yīng)特征

NaCl脅迫可對植物產(chǎn)生水分脅迫，促使植物體內(nèi)積累各種有機物質(zhì)以提高細(xì)胞液濃度，降低細(xì)胞液的滲透勢，保持一定的壓力勢，維持體內(nèi)水分，以適應(yīng)NaCl脅迫環(huán)境?？扇苄蕴恰⒖扇苄缘鞍资侵参矬w內(nèi)有效的滲透調(diào)節(jié)劑?？扇苄蕴前ㄕ崽?、葡萄糖、果糖、半乳糖等，其積累主要是由于淀粉等大分子碳水化合物的分解作用。其中，可溶性糖還是合成其他有機溶質(zhì)的碳架和能量來源，對細(xì)胞質(zhì)膜和原生膠體有穩(wěn)定作用，可在細(xì)胞內(nèi)無機離子濃度高時起保護(hù)酶類的作用[18]?？扇苄缘鞍缀颗c植物的保水能力有一定的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，可溶性蛋白及可溶性糖含量在NaCl脅迫過程中表現(xiàn)出相似的變化趨勢，推測前期降低的原因可能是二者對NaCl脅迫比較敏感，細(xì)胞受到脅迫傷害后其體內(nèi)通過分解可溶性蛋白及可溶性糖以應(yīng)對脅迫傷害，經(jīng)過一定時間后耐受性增強，促使其產(chǎn)生更多的可溶性蛋白和可溶性糖來平衡細(xì)胞內(nèi)外的滲透性。其中NaCl脅迫2 d可明顯促進(jìn)可溶性蛋白的積累，降低細(xì)胞滲透勢，增強滲透調(diào)節(jié)能力，維持植物正常的生長生理需求。而NaCl脅迫處理不同時間后可溶性糖的積累均受到抑制，說明一定時間的NaCl脅迫致使苗期水飛薊體內(nèi)大分子化合物分解，從而影響可溶性糖的積累，再加上植物生理機能的破壞，加快了可溶性蛋白和可溶性糖的分解速度，最后表現(xiàn)為一定時間的NaCl脅迫后兩者含量均顯著低于對照。

3.3 NaCl脅迫下苗期水飛薊總黃酮及水飛薊賓含量的響應(yīng)特征

NaCl脅迫條件下，植物次生代謝產(chǎn)物的合成水平會提高，次生代謝產(chǎn)物含量會增加。在NaCl脅迫處理T3、T4、T5時，苗期水飛薊葉片總黃酮含量隨著NaCl脅迫時間的增加而增加，說明一定時間內(nèi)NaCl脅迫可能激發(fā)了其體內(nèi)的次生代謝，能促進(jìn)某些代謝途徑中的防御性次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和增加。在NaCl脅迫處理初期，苗期水飛薊的總黃酮含量略微降低，原因可能是在NaCl脅迫初期次生代謝系統(tǒng)的防御功能需要一定的緩沖時間，總黃酮無法積累而致使其含量有所降低。

水飛薊賓屬于黃酮類化合物，在NaCl脅迫處理下，葉片的水飛薊賓含量隨著NaCl脅迫時間的增加呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。但各處理中含量最高的T5處理的水飛薊賓仍低于CK，推測原因可能是NaCl脅迫時間不夠長。與總黃酮含量結(jié)果相對比發(fā)現(xiàn)，NaCl脅迫處理T3時，總黃酮含量開始升高，而水飛薊賓含量降至最低，之后兩者含量都有明顯的升高趨勢。推測原因可能是水飛薊賓對鹽脅迫的響應(yīng)較慢，其他黃酮類物質(zhì)的合成較多。

綜合分析，苗期水飛薊在適度的NaCl脅迫下，具有一定的耐鹽性，在NaCl脅迫處理后，葉片中葉綠素含量下降，光合作用受到抑制。SOD、POD與CAT活性在NaCl脅迫初期上升，NaCl脅迫后期其生理機制受到破壞而下降，可溶性糖含量顯著低于對照，總黃酮和水飛薊賓含量在NaCl脅迫初期時下降，在NaCl脅迫后期上升。由此推測苗期水飛薊的耐鹽機制可能為適度的NaCl脅迫下，通過提高保護(hù)酶活性和分解部分滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以緩解NaCl脅迫傷害，其體內(nèi)的次生代謝也受到抑制，但隨著脅迫時間的延長(T3～T5)，其體內(nèi)的次生代謝可能被激活，從而使其代謝產(chǎn)物的合成水平得以提高以抵御外界的滲透脅迫。