張永江， 魏 霜， 袁俊杰， 乾義柯， 李桂芬， 魏梅生

(1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176； 2.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東廣州 510632； 3.湛江出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東湛江 524000； 4.伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局，新疆伊寧 835221)

菜豆莢斑駁病毒(bean pod mottle virus，簡(jiǎn)稱BPMV)屬于豇豆花葉病毒科(Comoviridae)豇豆花葉病毒屬(Comovirus)，其自然寄主為大豆、豇豆、菜豆等豆科植物，實(shí)驗(yàn)寄主多達(dá)20屬25種；分布廣泛，在巴西、加拿大、美國(guó)、厄瓜多爾、秘魯?shù)却蠖巩a(chǎn)區(qū)均發(fā)現(xiàn)其危害[1-5]。該病毒通過(guò)汁液接觸、介體昆蟲及種子進(jìn)行傳播，根據(jù)侵染程度的不同，能夠造成3%～52%的產(chǎn)量損失并使大豆品質(zhì)降低[3]，如與大豆花葉病毒(soybean mosaic virus，簡(jiǎn)稱SMV)復(fù)合侵染，可造成大豆減產(chǎn)85%，其在美國(guó)發(fā)生嚴(yán)重，在我國(guó)目前尚未發(fā)現(xiàn)分布[6]，已被列入新修訂的植物檢疫性有害生物名單中。我國(guó)是全球最大的大豆進(jìn)口國(guó)，近年來(lái)，全國(guó)多個(gè)口岸檢疫部門多次從進(jìn)境美國(guó)、加拿大大豆中截獲BPMV，目前尚無(wú)有效的病毒防治方法，一旦BPMV傳入我國(guó)并定殖下來(lái)，將很難根除，加強(qiáng)出入境檢驗(yàn)檢疫工作是防止該病毒傳入的有效途徑之一。為保護(hù)我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全，迫切須要建立一套準(zhǔn)確快速的檢測(cè)方法應(yīng)用于進(jìn)出口快速檢疫。

目前，對(duì)BPMV的檢測(cè)方法主要有生物學(xué)檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)、電鏡觀察、PCR技術(shù)等，近年來(lái)多RT-PCR、重RT-PCR、免疫捕獲巢式RT-PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增等分子檢測(cè)技術(shù)也被應(yīng)用于BPMV的檢測(cè)[7-11]。PCR檢測(cè)方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、可用于大量樣品檢測(cè)的特點(diǎn)，然而這種經(jīng)典的技術(shù)需要復(fù)雜的溫度循環(huán)儀，且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，不符合口岸快速檢測(cè)通關(guān)的要求。重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification，簡(jiǎn)稱RPA)技術(shù)是近幾年出現(xiàn)的一種有望替代PCR的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，在2006年由英國(guó)TwistDx Inc公司研發(fā)出[12]，該技術(shù)主要依賴于3種酶分別為能結(jié)合單鏈寡核苷酸引物的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白、DNA聚合酶[13]，反應(yīng)過(guò)程中不需要模板鏈的熱變性，可以在恒定的低溫條件下完成核酸的快速擴(kuò)增，產(chǎn)物根據(jù)引物設(shè)計(jì)位點(diǎn)有特定大小的條帶。經(jīng)探索發(fā)現(xiàn)，在RPA體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶可以將RNA作為模板合成cDNA后再進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)一步法擴(kuò)增，利于RNA病毒核酸檢測(cè)[14-15]。該技術(shù)對(duì)設(shè)備依賴程度較低，在植物病害診斷、進(jìn)出口快速檢疫等方面具有巨大的應(yīng)用前景和市場(chǎng)。目前，國(guó)內(nèi)利用逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification，簡(jiǎn)稱RT-RPA)技術(shù)檢測(cè)BPMV的研究尚未見報(bào)道，本研究根據(jù)BPMV基因組的保守序列，設(shè)計(jì)特異性RPA引物，建立BPMV的RT-RPA檢測(cè)方法，并驗(yàn)證其特異性和靈敏度，皆在建立一種快速檢測(cè)BPMV的簡(jiǎn)便高效、特異性強(qiáng)、靈敏度高、適用于口岸快速檢測(cè)的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜豆莢斑駁病毒、南方菜豆花葉病毒(southern bean mosaic virus，簡(jiǎn)稱SBMV)、大豆花葉病毒(soybean mosaic virus，簡(jiǎn)稱SMV)、南芥菜花葉病毒(arabis mosaic virus，簡(jiǎn)稱ArMV)及煙草環(huán)斑病毒(tobacco ringspot virus，簡(jiǎn)稱TRSV)大豆種子樣品均保存于中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照為健康大豆種子，樣品經(jīng)PCR檢測(cè)和序列測(cè)定確認(rèn)后于-80 ℃凍干保存。植物總RNA提取試劑盒為天根生物科技有限公司產(chǎn)品；TwistAmp Basic RT購(gòu)自TwistDx Inc公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

金屬浴(Eppendorf ThermoMixer，由Eppendorf公司提供)、電泳儀(600SI，由上海博彩生物科技有限公司提供)、凝膠成像系統(tǒng)(GBOX-F3，由基因公司提供)。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取 參照試劑盒操作說(shuō)明，提取5種病毒樣品及陰性對(duì)照的總RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 RPA引物設(shè)計(jì) 參考RPA引物的設(shè)計(jì)要求，根據(jù)BPMV基因組(GenBank登錄號(hào)M62738.1)的保守序列，設(shè)計(jì)其RPA引物，擴(kuò)增片段大小為198 bp。上游引物為BPMV-F：5′-TATTTGTATGCTATGGTGCATGATAGTTCAGTGTC-3′；下游引物為BPMV-R：5′-TGTTCTCACTGTTGCCATTTGATTCC-AAAC-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3.3 RT-RPA檢測(cè) 以“1.3.1”節(jié)中制備的總RNA為模板，采用BPMV-F和BPMV-R引物進(jìn)行RT-RPA擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。RT-RPA擴(kuò)增體系(50 μL)的配制方法如下：向含有凍干酶粉的反應(yīng)管中加入再水化緩沖液(rehydration buffer)29.5 μL，去離子水14.0 μL，上、下游引物(終濃度為 0.4 μmol/L)各1.0 μL，模板RNA 2.0 μL，最后再加入醋酸鎂溶液(280 mmol/L)2.5 μL。將RT-RPA擴(kuò)增體系充分混勻，置于40 ℃金屬浴中反應(yīng)40 min。RT-RPA反應(yīng)結(jié)束后，向RT-RPA擴(kuò)增產(chǎn)物中加入50 μL苯酚/四氯化碳溶液，充分混勻后在12 000 r/min的轉(zhuǎn)鏈下離心2 min，取 5 μL 上清液在 1.5% 瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

1.3.4 RT-RPA檢測(cè)方法特異性評(píng)價(jià) 按照“1.3.3”節(jié) RT-RPA 檢測(cè)反應(yīng)體系，對(duì)供試樣品BPMV、SBMV、SMV、ArMV及TRSV共5種病毒的總RNA進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，對(duì)所建立的RT-RPA檢測(cè)方法特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.5 RT-RPA檢測(cè)方法靈敏度評(píng)價(jià) 將BPMV樣品總RNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，共5個(gè)稀釋度，以梯度稀釋的RNA為模板，按照“1.3.3”節(jié)的反應(yīng)體系進(jìn)行RT-RPA靈敏度試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-RPA檢測(cè)方法的特異性評(píng)價(jià)

由圖1可知，BPMV樣品能夠檢測(cè)到198 bp的特異性條帶，而SBMV、SMV、ArMV、TRSV樣品及陰性對(duì)照均未檢測(cè)到該條帶，證明該方法具有較強(qiáng)的特異性。

2.2 RT-RPA檢測(cè)方法的靈敏度評(píng)價(jià)

由圖2可知，當(dāng)稀釋度為10-4時(shí)，也可以檢測(cè)到約198 bp的目的條帶，當(dāng)稀釋度為10-5時(shí)，未能擴(kuò)增到目的條帶。

3 結(jié)論與討論

RPA技術(shù)是一種可使微量核酸在體外恒溫高效快速擴(kuò)增的新技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因、病原菌檢測(cè)及食品安全等領(lǐng)域[16-20]。與基于PCR的核酸擴(kuò)增技術(shù)相比，RPA技術(shù)不需要復(fù)雜的溫度循環(huán)裝置，操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)時(shí)間短、特異性強(qiáng)、敏感度高。與其他核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法(如核酸依賴性擴(kuò)增檢測(cè)、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增、鏈替代擴(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增、依賴解旋酶的恒溫基因擴(kuò)增及轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增技術(shù)等[21-23])相比，RPA技術(shù)不須要完成目標(biāo)核酸的熱變性，反應(yīng)時(shí)間更短，并且可以多通道同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶基因，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)可以根據(jù)不同的條件選擇恰當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法，非常實(shí)用。當(dāng)然RPA技術(shù)從發(fā)展至今才十余年，也存在一些不足：RPA體系運(yùn)行時(shí)，對(duì)體系中酶活性的要求較高，任何一種酶失活都能導(dǎo)致反應(yīng)停止；RPA反應(yīng)一般在37～42 ℃條件下進(jìn)行，低溫環(huán)境容易出現(xiàn)序列不匹配的產(chǎn)物[24]；RPA體系中，當(dāng)目的基因含量較低時(shí)，引物之間偶爾會(huì)形成引物二聚體，可能導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物產(chǎn)生[25]；利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對(duì)RPA產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，凝膠成像的結(jié)果會(huì)受到反應(yīng)體系中緩沖液等組分的影響，因此須要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化處理[26]。

本研究建立的利用RT-RPA檢測(cè)BPMV的方法，逆轉(zhuǎn)錄和RPA恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)在同一反應(yīng)管中連續(xù)進(jìn)行，操作簡(jiǎn)單，制備好RNA后僅須配制反應(yīng)體系，其后的逆轉(zhuǎn)錄和RPA擴(kuò)增過(guò)程僅依靠簡(jiǎn)單的恒溫裝置即可完成，大大簡(jiǎn)化了試驗(yàn)流程。利用凝膠電泳法檢測(cè)其擴(kuò)增引物，能夠檢測(cè)到BPMV的特異性條帶，而其他幾種植物病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說(shuō)明RPA方法特異性高，這是因?yàn)镽PA引物設(shè)計(jì)原理雖與PCR大體相同，也一樣需要上、下游2條引物，但RPA引物的長(zhǎng)度較PCR引物長(zhǎng)，通常由30～35個(gè)核苷酸組成，這就大大提高了RPA反應(yīng)中目的基因擴(kuò)增的準(zhǔn)確度。

目前，學(xué)者們已經(jīng)針對(duì)BPMV建立了多種檢測(cè)方法。張明哲等利用納米上轉(zhuǎn)換熒光技術(shù)檢測(cè)BPMV，檢測(cè)限度為 1 μg/mL，然而檢測(cè)時(shí)間需要2.5 h，且磁性納米粒子的制備步驟較為繁瑣，成本高，不適合大范圍推廣[27]；鄧叢良等利用細(xì)菌磁顆粒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)BPMV，靈敏度為10-3稀釋度，但是大豆種子中蛋白質(zhì)和油脂的含量高，細(xì)菌磁顆粒對(duì)BPMV粒子的吸附效果不佳[28]；易汪雪等利用單管實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法同時(shí)檢測(cè)大豆種子中的菜豆莢斑駁病毒和煙草環(huán)斑病毒，二者的檢測(cè)限度相當(dāng)，均可達(dá)到35 pg/mL，但該方法在樣品中同時(shí)含有BPMV和TRSV，且在含量較低時(shí)的檢測(cè)中比較有優(yōu)勢(shì)[29]；郭立新等利用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)BPMV，靈敏度為200 fg/25 μg，但該技術(shù)對(duì)引物設(shè)計(jì)要求較高，需要6條引物才能完成擴(kuò)增[30]。本研究建立的 RT-RPA 檢測(cè)BPMV的靈敏度為10-4稀釋度，該技術(shù)檢測(cè)時(shí)間短，成本低廉，引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便，僅需1對(duì)引物即可完成目的基因的擴(kuò)增，更適用于核酸快速檢測(cè)領(lǐng)域，可作為口岸快速篩查菜豆莢斑駁病毒的有效手段。

4 總結(jié)與展望

我國(guó)食用油業(yè)規(guī)模巨大，大豆需求量大，須要長(zhǎng)期大量地從國(guó)外進(jìn)口，但其攜帶的多種病毒會(huì)威脅我國(guó)大豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。RPA技術(shù)操作方便、特異性強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度高，擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方便，雖然存在一定的缺點(diǎn)，但隨著RPA技術(shù)的不斷發(fā)展、進(jìn)一步完善以及檢測(cè)步驟的改良，將有望在BPMV田間診斷、口岸檢驗(yàn)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，為BPMV的快速檢測(cè)和一線國(guó)門檢疫提供有效的技術(shù)支持。