亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        一步法逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶常溫擴增(RT-RPA)技術(shù)檢測菜豆莢斑駁病毒

        2018-12-05 07:50:16張永江袁俊杰乾義柯李桂芬魏梅生
        江蘇農(nóng)業(yè)科學 2018年21期
        關(guān)鍵詞:核酸靈敏度特異性

        張永江, 魏 霜, 袁俊杰, 乾義柯, 李桂芬, 魏梅生

        (1.中國檢驗檢疫科學研究院,北京 100176; 2.廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心,廣東廣州 510632; 3.湛江出入境檢驗檢疫局,廣東湛江 524000; 4.伊犁出入境檢驗檢疫局,新疆伊寧 835221)

        菜豆莢斑駁病毒(bean pod mottle virus,簡稱BPMV)屬于豇豆花葉病毒科(Comoviridae)豇豆花葉病毒屬(Comovirus),其自然寄主為大豆、豇豆、菜豆等豆科植物,實驗寄主多達20屬25種;分布廣泛,在巴西、加拿大、美國、厄瓜多爾、秘魯?shù)却蠖巩a(chǎn)區(qū)均發(fā)現(xiàn)其危害[1-5]。該病毒通過汁液接觸、介體昆蟲及種子進行傳播,根據(jù)侵染程度的不同,能夠造成3%~52%的產(chǎn)量損失并使大豆品質(zhì)降低[3],如與大豆花葉病毒(soybean mosaic virus,簡稱SMV)復(fù)合侵染,可造成大豆減產(chǎn)85%,其在美國發(fā)生嚴重,在我國目前尚未發(fā)現(xiàn)分布[6],已被列入新修訂的植物檢疫性有害生物名單中。我國是全球最大的大豆進口國,近年來,全國多個口岸檢疫部門多次從進境美國、加拿大大豆中截獲BPMV,目前尚無有效的病毒防治方法,一旦BPMV傳入我國并定殖下來,將很難根除,加強出入境檢驗檢疫工作是防止該病毒傳入的有效途徑之一。為保護我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全,迫切須要建立一套準確快速的檢測方法應(yīng)用于進出口快速檢疫。

        目前,對BPMV的檢測方法主要有生物學檢測、血清學檢測、電鏡觀察、PCR技術(shù)等,近年來多RT-PCR、重RT-PCR、免疫捕獲巢式RT-PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增等分子檢測技術(shù)也被應(yīng)用于BPMV的檢測[7-11]。PCR檢測方法具有靈敏度高、特異性強、可用于大量樣品檢測的特點,然而這種經(jīng)典的技術(shù)需要復(fù)雜的溫度循環(huán)儀,且檢測時間較長,不符合口岸快速檢測通關(guān)的要求。重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification,簡稱RPA)技術(shù)是近幾年出現(xiàn)的一種有望替代PCR的核酸恒溫擴增技術(shù),在2006年由英國TwistDx Inc公司研發(fā)出[12],該技術(shù)主要依賴于3種酶分別為能結(jié)合單鏈寡核苷酸引物的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白、DNA聚合酶[13],反應(yīng)過程中不需要模板鏈的熱變性,可以在恒定的低溫條件下完成核酸的快速擴增,產(chǎn)物根據(jù)引物設(shè)計位點有特定大小的條帶。經(jīng)探索發(fā)現(xiàn),在RPA體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶可以將RNA作為模板合成cDNA后再進行擴增,進而實現(xiàn)一步法擴增,利于RNA病毒核酸檢測[14-15]。該技術(shù)對設(shè)備依賴程度較低,在植物病害診斷、進出口快速檢疫等方面具有巨大的應(yīng)用前景和市場。目前,國內(nèi)利用逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification,簡稱RT-RPA)技術(shù)檢測BPMV的研究尚未見報道,本研究根據(jù)BPMV基因組的保守序列,設(shè)計特異性RPA引物,建立BPMV的RT-RPA檢測方法,并驗證其特異性和靈敏度,皆在建立一種快速檢測BPMV的簡便高效、特異性強、靈敏度高、適用于口岸快速檢測的方法。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        菜豆莢斑駁病毒、南方菜豆花葉病毒(southern bean mosaic virus,簡稱SBMV)、大豆花葉病毒(soybean mosaic virus,簡稱SMV)、南芥菜花葉病毒(arabis mosaic virus,簡稱ArMV)及煙草環(huán)斑病毒(tobacco ringspot virus,簡稱TRSV)大豆種子樣品均保存于中國檢驗檢疫科學研究院,同時設(shè)置陰性對照為健康大豆種子,樣品經(jīng)PCR檢測和序列測定確認后于-80 ℃凍干保存。植物總RNA提取試劑盒為天根生物科技有限公司產(chǎn)品;TwistAmp Basic RT購自TwistDx Inc公司。

        1.2 主要儀器與設(shè)備

        金屬浴(Eppendorf ThermoMixer,由Eppendorf公司提供)、電泳儀(600SI,由上海博彩生物科技有限公司提供)、凝膠成像系統(tǒng)(GBOX-F3,由基因公司提供)。

        1.3 方法

        1.3.1 RNA提取 參照試劑盒操作說明,提取5種病毒樣品及陰性對照的總RNA,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3.2 RPA引物設(shè)計 參考RPA引物的設(shè)計要求,根據(jù)BPMV基因組(GenBank登錄號M62738.1)的保守序列,設(shè)計其RPA引物,擴增片段大小為198 bp。上游引物為BPMV-F:5′-TATTTGTATGCTATGGTGCATGATAGTTCAGTGTC-3′;下游引物為BPMV-R:5′-TGTTCTCACTGTTGCCATTTGATTCC-AAAC-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

        1.3.3 RT-RPA檢測 以“1.3.1”節(jié)中制備的總RNA為模板,采用BPMV-F和BPMV-R引物進行RT-RPA擴增,同時設(shè)置陰性對照。RT-RPA擴增體系(50 μL)的配制方法如下:向含有凍干酶粉的反應(yīng)管中加入再水化緩沖液(rehydration buffer)29.5 μL,去離子水14.0 μL,上、下游引物(終濃度為 0.4 μmol/L)各1.0 μL,模板RNA 2.0 μL,最后再加入醋酸鎂溶液(280 mmol/L)2.5 μL。將RT-RPA擴增體系充分混勻,置于40 ℃金屬浴中反應(yīng)40 min。RT-RPA反應(yīng)結(jié)束后,向RT-RPA擴增產(chǎn)物中加入50 μL苯酚/四氯化碳溶液,充分混勻后在12 000 r/min的轉(zhuǎn)鏈下離心2 min,取 5 μL 上清液在 1.5% 瓊脂糖凝膠上進行電泳,在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

        1.3.4 RT-RPA檢測方法特異性評價 按照“1.3.3”節(jié) RT-RPA 檢測反應(yīng)體系,對供試樣品BPMV、SBMV、SMV、ArMV及TRSV共5種病毒的總RNA進行檢測,同時設(shè)置陰性對照,對所建立的RT-RPA檢測方法特異性進行評價。

        1.3.5 RT-RPA檢測方法靈敏度評價 將BPMV樣品總RNA進行10倍梯度稀釋,共5個稀釋度,以梯度稀釋的RNA為模板,按照“1.3.3”節(jié)的反應(yīng)體系進行RT-RPA靈敏度試驗。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 RT-RPA檢測方法的特異性評價

        由圖1可知,BPMV樣品能夠檢測到198 bp的特異性條帶,而SBMV、SMV、ArMV、TRSV樣品及陰性對照均未檢測到該條帶,證明該方法具有較強的特異性。

        2.2 RT-RPA檢測方法的靈敏度評價

        由圖2可知,當稀釋度為10-4時,也可以檢測到約198 bp的目的條帶,當稀釋度為10-5時,未能擴增到目的條帶。

        3 結(jié)論與討論

        RPA技術(shù)是一種可使微量核酸在體外恒溫高效快速擴增的新技術(shù),已被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因、病原菌檢測及食品安全等領(lǐng)域[16-20]。與基于PCR的核酸擴增技術(shù)相比,RPA技術(shù)不需要復(fù)雜的溫度循環(huán)裝置,操作簡便、反應(yīng)時間短、特異性強、敏感度高。與其他核酸恒溫擴增方法(如核酸依賴性擴增檢測、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增、鏈替代擴增、滾環(huán)擴增、依賴解旋酶的恒溫基因擴增及轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增技術(shù)等[21-23])相比,RPA技術(shù)不須要完成目標核酸的熱變性,反應(yīng)時間更短,并且可以多通道同時檢測多個靶基因,檢測擴增產(chǎn)物時可以根據(jù)不同的條件選擇恰當?shù)臋z測方法,非常實用。當然RPA技術(shù)從發(fā)展至今才十余年,也存在一些不足:RPA體系運行時,對體系中酶活性的要求較高,任何一種酶失活都能導(dǎo)致反應(yīng)停止;RPA反應(yīng)一般在37~42 ℃條件下進行,低溫環(huán)境容易出現(xiàn)序列不匹配的產(chǎn)物[24];RPA體系中,當目的基因含量較低時,引物之間偶爾會形成引物二聚體,可能導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物產(chǎn)生[25];利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對RPA產(chǎn)物進行檢測時,凝膠成像的結(jié)果會受到反應(yīng)體系中緩沖液等組分的影響,因此須要對產(chǎn)物進行純化處理[26]。

        本研究建立的利用RT-RPA檢測BPMV的方法,逆轉(zhuǎn)錄和RPA恒溫擴增反應(yīng)在同一反應(yīng)管中連續(xù)進行,操作簡單,制備好RNA后僅須配制反應(yīng)體系,其后的逆轉(zhuǎn)錄和RPA擴增過程僅依靠簡單的恒溫裝置即可完成,大大簡化了試驗流程。利用凝膠電泳法檢測其擴增引物,能夠檢測到BPMV的特異性條帶,而其他幾種植物病毒的檢測結(jié)果均為陰性,說明RPA方法特異性高,這是因為RPA引物設(shè)計原理雖與PCR大體相同,也一樣需要上、下游2條引物,但RPA引物的長度較PCR引物長,通常由30~35個核苷酸組成,這就大大提高了RPA反應(yīng)中目的基因擴增的準確度。

        目前,學者們已經(jīng)針對BPMV建立了多種檢測方法。張明哲等利用納米上轉(zhuǎn)換熒光技術(shù)檢測BPMV,檢測限度為 1 μg/mL,然而檢測時間需要2.5 h,且磁性納米粒子的制備步驟較為繁瑣,成本高,不適合大范圍推廣[27];鄧叢良等利用細菌磁顆粒實時熒光RT-PCR檢測BPMV,靈敏度為10-3稀釋度,但是大豆種子中蛋白質(zhì)和油脂的含量高,細菌磁顆粒對BPMV粒子的吸附效果不佳[28];易汪雪等利用單管實時熒光RT-PCR方法同時檢測大豆種子中的菜豆莢斑駁病毒和煙草環(huán)斑病毒,二者的檢測限度相當,均可達到35 pg/mL,但該方法在樣品中同時含有BPMV和TRSV,且在含量較低時的檢測中比較有優(yōu)勢[29];郭立新等利用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測BPMV,靈敏度為200 fg/25 μg,但該技術(shù)對引物設(shè)計要求較高,需要6條引物才能完成擴增[30]。本研究建立的 RT-RPA 檢測BPMV的靈敏度為10-4稀釋度,該技術(shù)檢測時間短,成本低廉,引物設(shè)計簡便,僅需1對引物即可完成目的基因的擴增,更適用于核酸快速檢測領(lǐng)域,可作為口岸快速篩查菜豆莢斑駁病毒的有效手段。

        4 總結(jié)與展望

        我國食用油業(yè)規(guī)模巨大,大豆需求量大,須要長期大量地從國外進口,但其攜帶的多種病毒會威脅我國大豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。RPA技術(shù)操作方便、特異性強、檢測靈敏度高,擴增產(chǎn)物檢測方便,雖然存在一定的缺點,但隨著RPA技術(shù)的不斷發(fā)展、進一步完善以及檢測步驟的改良,將有望在BPMV田間診斷、口岸檢驗等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用,為BPMV的快速檢測和一線國門檢疫提供有效的技術(shù)支持。

        猜你喜歡
        核酸靈敏度特異性
        測核酸
        中華詩詞(2022年9期)2022-07-29 08:33:50
        全員核酸
        中國慈善家(2022年3期)2022-06-14 22:21:55
        第一次做核酸檢測
        快樂語文(2021年34期)2022-01-18 06:04:14
        核酸檢測
        中國(俄文)(2020年8期)2020-11-23 03:37:13
        導(dǎo)磁環(huán)對LVDT線性度和靈敏度的影響
        地下水非穩(wěn)定流的靈敏度分析
        精確制導(dǎo) 特異性溶栓
        BOPIM-dma作為BSA Site Ⅰ特異性探針的研究及其應(yīng)用
        重復(fù)周圍磁刺激治療慢性非特異性下腰痛的臨床效果
        穿甲爆破彈引信對薄弱目標的靈敏度分析
        日韩久久久久中文字幕人妻| 亚洲一区二区三区av无码| 超薄丝袜足j好爽在线观看| 国产又色又爽又刺激视频| 风流少妇一区二区三区| 中文字幕av长濑麻美| 少妇被粗大的猛烈进出免费视频 | 国产精品免费久久久久软件| av一区二区三区亚洲| 日本女优禁断视频中文字幕| 无码av天天av天天爽| 色欲av自慰一区二区三区| 精品国偷自产在线不卡短视频| 五十路在线中文字幕在线中文字幕| 国产高清乱码又大又圆| 好日子在线观看视频大全免费动漫| 麻豆变态另类视频在线观看| 美腿丝袜网址亚洲av| 欧洲美女黑人粗性暴交视频| 亚洲精品aa片在线观看国产| 国产视频网站一区二区三区| 国产诱惑人的视频在线观看| 久久亚洲日韩精品一区二区三区| 国产亚洲av片在线观看18女人| 国产综合精品久久久久成人| 99久久婷婷国产精品网| 在线观看视频播放| 国产精品亚洲综合久久婷婷| 91蜜桃精品一区二区三区毛片| 亚洲一区二区三区中国| 曰批免费视频播放免费直播 | 内射少妇36p九色| 日韩免费高清视频网站| 国产视频一区二区三区观看| 免费黄色影片| 在线视频你懂的国产福利| 尤物成av人片在线观看| 曰韩无码av一区二区免费| 亚洲国产精品久久久久秋霞影院| 国模少妇无码一区二区三区| 亚洲第一女人的天堂av|