吳 萌， 朱善元， 吳海濤， 張繼玲， 王安平

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300)

番鴨細(xì)小病毒病是由番鴨細(xì)小病毒(muscovy duck parvovirus，簡(jiǎn)稱MDPV)引起的雛番鴨的一種急性、敗血性傳染病[1]，主要感染3周齡以內(nèi)的雛番鴨，俗稱三周病[2-3]。該病作為一種病毒病，重在預(yù)防，目前疫苗接種是最主要的預(yù)防方式。我國(guó)多在雛番鴨1日齡時(shí)進(jìn)行MDPV弱毒苗免疫，但由于母源抗體的影響，以致弱毒苗不能對(duì)番鴨完全保護(hù)，國(guó)內(nèi)外常有該病的報(bào)道[4]。因此，研究更為有效安全的MDPV疫苗是目前迫切的任務(wù)。

桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)(baculovirus expression vector system，簡(jiǎn)稱BEVS)是一個(gè)以昆蟲桿狀病毒為外源基因載體，以昆蟲和昆蟲細(xì)胞為受體的真核表達(dá)系統(tǒng)。該表達(dá)系統(tǒng)具有安全性高、對(duì)外源基因容量大、較好地轉(zhuǎn)錄后加工修飾等優(yōu)點(diǎn)[5]。在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)這些優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，眾多學(xué)者對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)一步進(jìn)行研究改進(jìn)，最為重要的是Bac-to-Bac系統(tǒng)的構(gòu)建[6]，使桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)能更好地適應(yīng)基礎(chǔ)研究和應(yīng)用開發(fā)的需要。

本研究旨在Bac-to-Bac系統(tǒng)中成功表達(dá)番鴨細(xì)小病毒的VP3基因，為制備VLPs提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與血清 MDPV尿囊液、MDPV抗鼠多抗、PFastBac1載體、大腸桿菌DH5α、DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞由筆者所在實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 酶類和主要試劑pfuDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶NotⅠ、XhoⅠ及T4DNA連接酶購(gòu)自加拿大Fermentas公司；質(zhì)粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司；FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)自SouthernBiotech公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank中已發(fā)表的MDPVVP3的基因序列(登錄號(hào)：AY510603.1)，設(shè)計(jì)1對(duì)用于擴(kuò)增VP3基因的引物，引物由英濰捷基(上海)生物技術(shù)有限公司合成。引物序列為VP3-FB-F：5′-TATGGATCCATG GCAGAGGGAGGAAGC-3′；VP3-FB-R：5′-TAAGAGCT CCAGATTCTGAGTCAAATACC-3′。序列下劃線處分別為上下游引物插入的NotⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。

1.2.2VP3基因的擴(kuò)增 將MDPV尿囊液煮沸5 min，-20 ℃ 冷凍10 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清為模板，VP3-FB-F、VP3-FB-R為上下游引物擴(kuò)增VP3基因。反應(yīng)體系：模板2 μL、dNTP(2.5 mmol/L)5 μL、10×PCR緩沖液5 μL、上下游引物(25 mmol/L)各2 μL、pfuDNA聚合酶(5 U/μL)1 μL，加雙蒸水至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，49 ℃退火30 s，72 ℃延伸 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-VP3的構(gòu)建與鑒定 按膠回收試劑盒的說(shuō)明書回收目的基因，經(jīng)NotⅠ和BamHⅠ酶切后與經(jīng)同樣酶切的pFastBac1載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取可疑單菌落培養(yǎng)，PCR初步鑒定，將鑒定正確的菌落提取質(zhì)粒，并以NotⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定。酶切鑒定正確的菌株送至英濰捷基(上海)生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的命名為轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-VP3。

1.2.4 重組Bacmid DNA的獲得與鑒定 將PFastBac1-VP3重組轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有50 μg/mL卡那霉素、7 μg/mL慶大霉素、10 μg/mL四環(huán)素、100 μg/mL X-gal及40 μg/mL異丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h后出現(xiàn)藍(lán)白斑現(xiàn)象。將疑似的白色單菌落接種到含有50 μg/mL卡那霉素、7 μg/mL慶大霉素及10 μg/mL四環(huán)素的10 mL抗性LB試管中，37 ℃、250 r/min 搖床培養(yǎng)過(guò)夜培養(yǎng)，提取重組Bacmid DNA。

以M13上下游引物對(duì)重組Bacmid DNA進(jìn)行鑒定，反應(yīng)體系為重組Bacmid DNA 2.0 μL，上下游引物(25 mmol/L)各 1.0 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2.5 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.0 μL，TaqDNA 酶(5 U/μL)0.5 μL，加雙蒸水至25 μL。PCR反應(yīng)條件：93 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，49 ℃退火45 s，72 ℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5 重組桿狀病毒的獲得與擴(kuò)增 將重組Bacmid DNA轉(zhuǎn)染處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的昆蟲細(xì)胞Sf9，27 ℃培養(yǎng)，待Sf9細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變(細(xì)胞核變大，細(xì)胞變大變圓，從瓶壁脫落)，收集上清即為P1代重組病毒。P1代重組桿狀病毒滴度一般比較低，須要用P1代病毒繼續(xù)傳代提高滴度。將P1代病毒感染Sf9細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞上清，即P2代重組桿狀病毒。以P2代病毒感染細(xì)胞，得到P3代重組桿狀病毒。

1.2.6 重組蛋白的鑒定

1.2.6.1 SDS-PAGE和Western-blot試驗(yàn) 將P3代病毒感染Sf9細(xì)胞，正常Sf9細(xì)胞作為空白對(duì)照，待被感染細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)，收集細(xì)胞沉淀。用適量磷酸緩沖鹽溶液(PBS)重懸沉淀，與上樣緩沖液混勻，煮沸10 min，進(jìn)行 SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色、脫色，分析結(jié)果。

SDS-PAGE結(jié)束后，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉 4 ℃ 封閉過(guò)夜，加入1 ∶400稀釋的一抗(MDPV多抗)，37 ℃孵育2 h，PBS洗滌5遍。加入1 ∶3 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育1.5 h，PBS洗滌5遍，而二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。

1.2.6.2 間接免疫熒光試驗(yàn) 將P3代病毒感染Sf9細(xì)胞，以正常Sf9細(xì)胞作為空白對(duì)照，48 h后，棄培養(yǎng)基上清，PBS洗滌。以預(yù)冷的甲醇固定10 min，PBS洗滌后，加入1 ∶400稀釋的一抗(MDPV多抗)，37 ℃孵育1 h。加入1 ∶500稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育45 min，PBS洗滌后，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 VP3基因的克隆

以處理的MDPV尿囊液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果出現(xiàn)1條約1 602 bp大小的特異性條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2 轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-VP3的構(gòu)建與酶切鑒定

將PCR擴(kuò)增的VP3基因經(jīng)瓊脂糖凝膠分離后，切膠回收，用BamHⅠ和NotⅠ雙酶切，與經(jīng)同樣酶切的pFastBac1質(zhì)粒連接，獲得轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-VP3。經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ雙酶切得到約1.6 kb和4.7 kb的2條條帶(圖2)，與預(yù)期結(jié)果相符，且DNA測(cè)序結(jié)果證明VP3基因克隆正確。

2.3 重組Bacmid DNA的PCR鑒定

以M13上下游引物對(duì)重組Bacmid DNA進(jìn)行PCR鑒定。由圖3可知，重組質(zhì)粒以M13為上下游引物時(shí)，出現(xiàn)大小約3.9 kb(2.3 kb+1.6 kb)的條帶；以VP3-PFB-F、VP3-PFB-R為上下游引物時(shí)，出現(xiàn)大小約 1.6 kb 的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.4 重組蛋白的鑒定

2.4.1 SDS-PAGE分析 以P3代重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)，收集細(xì)胞，進(jìn)行SDS-PAGE。染色脫色后，觀察結(jié)果。由圖4可知，被感染的Sf9細(xì)胞在約58 ku 處出現(xiàn)特異性條帶，空白對(duì)照沒(méi)有。

2.4.2 Western-blot檢測(cè) 對(duì)重組蛋白進(jìn)行Western-blot檢測(cè)。由圖5可知，重組蛋白在約58 ku處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。表明在Sf9細(xì)胞中表達(dá)的重組蛋白能與MDPV多抗發(fā)生特異性反應(yīng)。

2.4.3 間接免疫熒光試驗(yàn) 以P3代重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)，以甲醇固定進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)。由圖6可知，P3代病毒感染的細(xì)胞出現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光，而正常細(xì)胞中未見熒光。

3 討論

番鴨細(xì)小病毒最早被報(bào)道是在1991年，林世堂等認(rèn)為是類似小鵝瘟的番鴨病毒病的一種新病毒[1]，隨后程由銓等分離到2株病毒，最后確定本病的病原是細(xì)小病毒科的一個(gè)新成員[7]。番鴨細(xì)小病毒的基因組為單鏈線性DNA，全長(zhǎng) 5 136 bp，包含2個(gè)主要的開放閱讀框(ORF)。左側(cè)ORF編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)；右側(cè)ORF編碼病毒的3種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3)。其中VP3是主要的衣殼蛋白，約占總蛋白的80%，能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體[8-9]，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體的主要抗原[10]。

桿狀病毒基因組較大，不易通過(guò)常規(guī)的酶切連接將外源片段插入其中，通常是將外源片段連接到轉(zhuǎn)移載體上[11]，然后轉(zhuǎn)移載體與桿狀病毒重組，獲得重組桿狀病毒。最初重組桿狀病毒構(gòu)建時(shí)應(yīng)用的是野生型病毒，該方法重組效率僅 0.1%～1.0%[12]，費(fèi)事費(fèi)力，因此在應(yīng)用上有一定的難度。隨著桿狀病毒載體和篩選方法的不斷改進(jìn)，1993年 Bac-to-Bac技術(shù)問(wèn)世。Bac-to-Bac技術(shù)是根據(jù)F因子載體原理，構(gòu)建一種桿狀病毒穿梭載體[13]，該載體既可像普通質(zhì)粒一樣在大腸桿菌中復(fù)制，又能感染昆蟲細(xì)胞。該方法可使桿狀病毒的最大重組率高達(dá)100%，并且操作簡(jiǎn)單，提高了工作效率。

本試驗(yàn)選擇MDPV主要衣殼蛋白基因VP3，將其克隆至pFastBac1載體上，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-VP3；轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選及PCR鑒定后，獲得重組Bacmid DNA。將重組Bacmid DNA感染昆蟲細(xì)胞，制備重組桿狀病毒rBac-VP3，并通過(guò)SDS-PAGE分析、Western-blot、間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)。結(jié)果證明，VP3基因能在桿狀病毒系統(tǒng)中正確表達(dá)，為病毒樣顆粒在昆蟲細(xì)胞中的自主裝配提供了有力條件和基礎(chǔ)。