武麗娟， 陳月星， 劉小鳳， 宋 月， 張戰(zhàn)鳳， 樊永亮

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，陜西楊凌 712100； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

土壤微生物是陸地生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分，積極參與土壤養(yǎng)分循環(huán)、有機(jī)質(zhì)分解及肥力形成等重要的生態(tài)過(guò)程[1]。它們的生存很容易受到很多環(huán)境因子的影響，如污染物、地表植被、土地利用方式、土壤類型等，因此常常被認(rèn)為是土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的指示者。除了對(duì)與土壤微生物密切相關(guān)的土壤酶和土壤微生物量的研究外，近年來(lái)，對(duì)土壤微生物多樣性的研究密集起來(lái)，這主要得益于不依賴微生物培養(yǎng)的分子生物學(xué)技術(shù)[脂肪酸甲酯/磷脂脂肪酸(FAME/PLFA)、擴(kuò)增的rDNA限制性分析(ARDRA)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(T-RFLP)、腸桿菌重復(fù)基因間一致序列PCR(ERIC-PCR)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、16S rDNA序列分析]的發(fā)展和DNA測(cè)序技術(shù)的日益成熟。自Muyzer等將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)引入到微生物多樣性分析以來(lái)[2]，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)各種環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性、監(jiān)測(cè)微生物群落動(dòng)態(tài)變化等方面[3-6]。然而在試驗(yàn)操作中，該技術(shù)各個(gè)環(huán)節(jié)均需完善才能準(zhǔn)確而科學(xué)地反映試驗(yàn)結(jié)果，以往研究主要集中于DNA提取[7-8]、靶序列選擇[9]及變性梯度摸索等方面，而對(duì)于PCR反應(yīng)程序的系統(tǒng)比較研究還未見(jiàn)報(bào)道，因此，本試驗(yàn)針對(duì)該技術(shù)的目的基因片段擴(kuò)增(PCR)環(huán)節(jié)，以16S rDNA基因V3區(qū)片段擴(kuò)增為例，比較4種不同的PCR反應(yīng)程序?qū)ν寥牢⑸颬CR-DGGE多樣性分析的影響，從而評(píng)價(jià)和篩選出適合于土壤微生物多樣性PCR-DGGE分析的反應(yīng)程序，以期為PCR-DGGE技術(shù)在土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和種群多樣性分析中的應(yīng)用和完善提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)儀器和試劑

儀器：基因擴(kuò)增儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)，渦旋儀、水浴鍋、高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)艾本德生命科學(xué)公司)，核酸突變檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)伯樂(lè)公司)，核酸電泳儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)伯樂(lè)公司)，藍(lán)盾?621可見(jiàn)光凝膠透射儀。

試劑：小量土壤DNA提取試劑盒(美國(guó)Omega公司)、DNA回收純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)、瓊脂糖，GenFinder核酸染料(廈門百維信生物科技有限公司)、GelRed核酸染料(美國(guó)Biotium生物技術(shù)公司)，rTaqDNA聚合酶和dNTPs[寶生物工程(大連)有限公司]，40%丙烯酰胺溶液(丙烯酰胺 ∶甲叉丙烯酰胺=37.5 ∶1)、四甲基乙二胺(TEMED)、過(guò)硫酸銨(西隴)、PCR引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.2 研究區(qū)概況和土壤樣品的采集

本試驗(yàn)所用土樣采集于延安市果業(yè)研究發(fā)展中心蘋果試驗(yàn)基地，該區(qū)域位于渭北旱塬核心地段，屬于溫帶半濕潤(rùn)大陸性季風(fēng)氣候，年均氣溫9.2 ℃，平均海拔1 100 m，多年平均降水量622 mm，主要集中于6—9月；地貌以塬、梁、溝相間，以塬為主；土壤為黃土母質(zhì)發(fā)育而成的疏松黑壚土。

于2011年10月19日蘋果成熟期，分別在蘋果生育期內(nèi)種植三葉草(TrifoliumrepensL.)和覆蓋玉米秸稈(30 000 kg/hm2)的園區(qū)采用多點(diǎn)采樣法采集土樣(地表下5～15 cm土層)，土樣均勻混合后裝入標(biāo)記好的無(wú)菌塑封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，取出石塊、草根、秸稈及其他肉眼可見(jiàn)的雜物，過(guò)2 mm鋼篩，于-80 ℃保存，7 d內(nèi)完成土壤微生物總DNA的提取。

1.3 土壤微生物總DNA的提取

土壤微生物總DNA采用小量土壤DNA提取試劑盒，參照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行提取，得到的DNA提取液經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 16S rRNA基因V3區(qū)片段的擴(kuò)增

本研究采用引物對(duì)27F[10]/1492R[11]和GC-338F/518R[2]分別對(duì)16S rDNA基因全長(zhǎng)和V3區(qū)片段進(jìn)行擴(kuò)增。16S rDNA基因全長(zhǎng)擴(kuò)增體系和程序參照Nicomrat等的方法[12]；V3區(qū)片段擴(kuò)增體系如下：10×PCR緩沖液(含Mg2+)5 μL，dNTPs(各2.5 mmol/L)4 μL，正反向引物(各 5 μmol/L)4 μL，模板DNA 2 μL，TaKaRa rTaq(5 U/μL)0.5 μL，補(bǔ)充雙蒸水至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)?/p>

A：降落式PCR。以提取的微生物總DNA為模板，進(jìn)行V3區(qū)片段擴(kuò)增，參考Kihara等的方法，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃ 變性30 s，65～55 ℃(每個(gè)循環(huán)退火溫度降低 0.5 ℃，直至退火溫度降至55 ℃)復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，20個(gè)循環(huán)；94 ℃ 變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸 1 min，10個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min[13]。

B：巢式-降落式PCR。以27F/1492R引物擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行V3區(qū)片段擴(kuò)增，反應(yīng)程序同A。

C：普通PCR。以提取的微生物總DNA為模板，進(jìn)行V3區(qū)片段擴(kuò)增，參考Kimura等的方法，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸8 min[14]。

D：巢式PCR。以27F/1492R引物擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行V3區(qū)片段擴(kuò)增，反應(yīng)程序同C。

每個(gè)土樣PCR均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，合并后采用瓊脂糖凝膠DNA回收和純化試劑盒進(jìn)行回收純化，依據(jù)試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行操作，濃縮產(chǎn)物保存于-20 ℃，以備DGGE分析。

1.5 DGGE分析

應(yīng)用美國(guó)伯樂(lè)公司核酸突變檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行DGGE分析，凝膠的變性梯度為45%～65%(100%變性劑為7 mol/L尿素和40%去離子甲酰胺的混合物)，凝膠濃度為8%，在60 ℃、120 V條件下，凝膠在1×TAE緩沖液中電泳510 min。電泳完畢，將凝膠浸在含Gel Red(體積分?jǐn)?shù)為1 ∶10 000)的 1×TAE 溶液中避光染色10～15 min，采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.6 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Quantity One 4.6.2軟件對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行數(shù)字化分析，用以計(jì)算香農(nóng)指數(shù)(H)、豐富度指數(shù)(R)、均勻度指數(shù)(E)和戴斯系數(shù)(D)，并利用SPPSS 16.0軟件應(yīng)用單因素方差分析方法檢測(cè)處理間的差異顯著性。相關(guān)指數(shù)計(jì)算公式如下：

(1)

E=H/lnS；

(2)

(3)

式中：Pi為某一條帶的峰強(qiáng)度與該泳道中所有條帶峰強(qiáng)度和的比值；S為某一泳道的DNA條帶數(shù)。Sx為泳道x中的條帶數(shù)；Sy為泳道y中的條帶數(shù)；Sc為泳道x和泳道y所共有的條帶數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物總DNA提取和16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增

2.1.1 土壤微生物總DNA提取 本試驗(yàn)采用土壤DNA提取試劑盒提取土壤微生物總DNA，所提取的DNA溶液D260 nm/D280 nm介于1.8～2.0之間，其D260 nm/D230 nm介于0.1～0.5之間；經(jīng)8%瓊脂糖凝膠電泳后得到單一、清晰的條帶，大小約為23 kb，說(shuō)明所提取的DNA溶液在純度和長(zhǎng)度上均滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

2.1.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果 應(yīng)用通用引物對(duì)27F/1492R擴(kuò)增16S rDNA基因全長(zhǎng)，并經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。由圖1可知，通過(guò)應(yīng)用27F/1492R引物對(duì)的擴(kuò)增，2份土樣均成功擴(kuò)增出16S rDNA基因的全長(zhǎng)序列，長(zhǎng)度約為1 500 bp。將擴(kuò)增得到的3份PCR反應(yīng)液進(jìn)行合并，經(jīng)DNA回收純化試劑盒回收純化后，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

應(yīng)用同樣的反應(yīng)體系，不同的反應(yīng)程序擴(kuò)增16S rDNA基因V3區(qū)片段，并經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。由圖2-A和圖2-B可知，用4種不同的PCR反應(yīng)程序，2份土樣的所有處理樣品均擴(kuò)增出正確大小的目的片段，約為220 bp；重復(fù)之間和不同反應(yīng)程序之間，電泳條帶的大小和強(qiáng)度沒(méi)有明顯差異，而在2份土樣之間，植草覆蓋果園土樣(G)比秸稈覆蓋果園土樣(S)亮度暗。同一處理的PCR反應(yīng)液合并后經(jīng)DNA純化回收試劑盒回收純化，于-20 ℃冰箱保存，以備DGGE分析。

2.2 DGGE圖譜分析

應(yīng)用PCR-DGGE分析自然環(huán)境中細(xì)菌、古菌、真核生物及病毒群落的生物多樣性，通過(guò)添加化學(xué)變性劑使DNA在電泳過(guò)程中發(fā)生解鏈變性，降低遷移率，從而使不同DNA分子得以分離。理論上，DGGE圖譜上1個(gè)條帶代表1個(gè)微生物優(yōu)勢(shì)菌群或操作分類單，條帶數(shù)目的多寡反映細(xì)菌的多樣性高低，對(duì)應(yīng)條帶的強(qiáng)度反映該優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度，因此可以依據(jù)圖譜中的條帶信息分析樣品中微生物的群落結(jié)構(gòu)和微生物種群多樣性。

4種不同PCR反應(yīng)程序下土壤微生物多樣性DGGE指紋圖譜見(jiàn)圖3，通過(guò)對(duì)DGGE圖譜的初步分析，可以發(fā)現(xiàn)，2個(gè)土樣DGGE圖譜中的各泳道的條帶數(shù)目比較豐富、遷移率及條帶亮度間存在一定差異，說(shuō)明2份土樣所含微生物多樣性較高，且樣品間微生物種類和數(shù)量差異較大；同時(shí)2個(gè)土樣圖譜中存在若干共同條帶，說(shuō)明供試土樣中存在多種共有細(xì)菌；樣品內(nèi)不同反應(yīng)程序處理間各泳道的條帶數(shù)目、亮度及遷移率也存在一定差異，說(shuō)明不同的PCR反應(yīng)程序?qū)GGE多樣性分析存在一定的影響，且明顯可以看出，A與B、C、D差異較為明顯，而B(niǎo)、C、D之間條帶類型較為相似。

2.3 不同PCR反應(yīng)程序下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

應(yīng)用Quantity One 4.6.2軟件對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行數(shù)字化處理，并計(jì)算樣品中各泳道的多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)。由表1可知，2個(gè)土樣不同處理間多樣性指數(shù)相似，A處理的多樣性指數(shù)最低，與B處理間差異顯著(P<0.05)；B、C、D處理多樣性指數(shù)均大于等于3.10，且C、D處理間無(wú)顯著差異。豐富度指數(shù)與多樣性指數(shù)比較結(jié)果相似，2個(gè)土樣中A處理的豐富度最低，分別為25(G)和24(S)，且與C、D處理間差異顯著(P<0.05)，B、C、D豐富度指數(shù)無(wú)顯著性差異。結(jié)果表明，單純應(yīng)用降落式PCR在提高擴(kuò)增特異性的同時(shí)降低了擴(kuò)增效率，從而導(dǎo)致DGGE圖譜條帶數(shù)目較少，反映樣品中微生物種群多樣性較低；在巢式-降落式PCR、普通PCR和巢式PCR擴(kuò)增條件下，DGGE圖譜多樣性較好、豐富度指數(shù)較高， 能夠較好地反映土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和種群多樣性，并且表現(xiàn)出較好的一致性。

表1 不同PCR反應(yīng)程序下土壤微生物多樣性指數(shù)

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示經(jīng)Duncan’s檢驗(yàn)在0.05水平上差異顯著。A表示降落式PCR；B表示巢式-降落式PCR；C表示普通PCR；D表示巢式PCR。下表同。

2.4 群落相似性分析

DGGE圖譜經(jīng)Quantity One 4.6.2軟件分析，通過(guò)戴斯系數(shù)公式計(jì)算2份土樣在4個(gè)不同PCR反應(yīng)程序下各泳道的戴斯系數(shù)，得到相似性矩陣(表2、表3)。2個(gè)土樣中降落式PCR與其他3個(gè)處理相似度普遍較低，最低為0.78；普通PCR與其他3個(gè)PCR處理相似度比較低，主要因?yàn)槠胀≒CR在擴(kuò)增復(fù)雜模板時(shí)存在一定的非特異性擴(kuò)增，表現(xiàn)在DGGE圖譜上為出現(xiàn)不代表任何細(xì)菌種群的特異條帶，從而夸大樣品中微生物的種群多樣性和豐富度；巢式-降落式PCR和巢式PCR處理間一致性較高，具有相似的微生物群落結(jié)構(gòu)，尤其S的巢式-降落式PCR和巢式PCR處理反映的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)基本一致，相似度為0.97，說(shuō)明巢式PCR不僅確保了擴(kuò)增的特異性，且克服了降落式PCR擴(kuò)增效率低的問(wèn)題。

表2 不同反應(yīng)程序下植草覆蓋果園土壤樣品微生物群落結(jié)構(gòu)相似性分析

表3 不同反應(yīng)程序下秸稈覆蓋果園土壤樣品微生物群落結(jié)構(gòu)相似性分析

3 討論

DGGE凝膠電泳技術(shù)于1979年被提出，是一種用于DNA突變檢測(cè)的分子生物技術(shù)[15]，該技術(shù)被Muyzer等[2]引入到微生物生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域，并證實(shí)了該技術(shù)在自然界微生物生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域的實(shí)用性和優(yōu)越性。這是因?yàn)?1)DGGE是一種不依賴于純培養(yǎng)的DNA片段分離技術(shù)，能夠較全面反映樣品中微生物的群落結(jié)構(gòu)、種類和數(shù)量；(2)DGGE凝膠電泳可以同時(shí)運(yùn)行多個(gè)樣品，適用于研究環(huán)境樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)的演替規(guī)律、種群動(dòng)態(tài)變化等；(3)DGGE凝膠電泳具有重現(xiàn)性高、可靠性強(qiáng)及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，因此DGGE自誕生以來(lái)被廣泛應(yīng)用于各種環(huán)境(土壤、活性污泥、生物膜、動(dòng)物腸胃以及水生生態(tài)環(huán)境)微生物多樣性的檢測(cè)及群落動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的研究。

然而，與其他分子生物技術(shù)一樣，DGGE技術(shù)也存在一定的局限性，如只能分離500 bp以下的DNA片段，序列信息量較?。痪哂邢嗤怄溞袨榈奈⑸顳NA序列在DGGE圖譜上遷移率一致，無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分；DGGE只能檢測(cè)環(huán)境中優(yōu)勢(shì)菌群的種類和數(shù)量(1%以上)，且無(wú)法提供代謝活性和基因表達(dá)水平方面的信息。除此之外，DGGE圖譜分析還受到各操作環(huán)節(jié)的影響，包括總DNA的提取、PCR擴(kuò)增引物選擇、凝膠和變性劑梯度的設(shè)置、電泳溫度和時(shí)間的確定、染色方法的選擇[16-17]以及后續(xù)條帶的測(cè)序步驟[18]。

本研究針對(duì)PCR擴(kuò)增環(huán)節(jié)，采用目前DGGE分析中比較常用的4種擴(kuò)增程序(A：降落式PCR；B：巢式-降落式PCR；C：普通PCR；D：巢式PCR)對(duì)16S rDNA基因V3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，并進(jìn)行DGGE圖譜分析，結(jié)果表明，與普通PCR和降落式PCR相比，巢式PCR(巢式PCR和巢式-降落式PCR)所獲得的DGGE條帶較為清晰，條帶數(shù)目較豐富。雷娟利等在研究不同蔬菜連作對(duì)土壤細(xì)菌DNA分子水平多態(tài)性影響中也發(fā)現(xiàn)，巢式PCR所獲得的DGGE條帶比直接PCR更清晰，可分辨的條帶數(shù)量也更多[19]。同樣，江蕓等在研究真空包裝冷卻豬肉冷藏過(guò)程中菌相變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，巢式PCR(巢式-降落式PCR)能夠增加PCR反應(yīng)的靈敏性[20]。表明在其他技術(shù)操作相同的情況下，巢式PCR(巢式PCR和巢式-降落式PCR)比其他PCR更適用于土壤及其他微生物群落結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的樣品的PCR-DGGE分析。

然而，PCR只是PCR-DGGE技術(shù)流程的一個(gè)環(huán)節(jié)，保證PCR擴(kuò)增的特異性和效率是整個(gè)試驗(yàn)的一部分，其他環(huán)節(jié)對(duì)DGGE圖譜分析同樣也存在一定影響，因此，在應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析時(shí)，須摸索和完善各個(gè)環(huán)節(jié)才能得到全面和科學(xué)的結(jié)果。

4 結(jié)論

綜上所述，應(yīng)用PCR-DGGE分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和種群多樣性時(shí)，不同的PCR反應(yīng)程序獲得的DGGE圖譜分析結(jié)果存在明顯差異。本試驗(yàn)結(jié)果表明，巢式PCR(巢式PCR和巢式-降落式PCR)反應(yīng)處理下的DGGE圖譜條帶豐富，多樣性高，能夠比較全面和科學(xué)地反映樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)和種群多樣性。