張 彥 石 涼 秦 鳳 童曉琪 黃 浩 黃德輝

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所，安徽合肥 230061)

暗化型(mln) 家蠶是家蠶體色突變中少見(jiàn)的全齡期表現(xiàn)黑化的突變：突變體幼蟲(chóng)頭部、胸足、肛板等骨化部位均呈黑褐色，蛹后期為黑色，成蟲(chóng)期全身包括蛾翅在內(nèi)都有明顯的黑化現(xiàn)象[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn)，該突變是由家蠶第18連鎖群上的芳香烷基胺N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因(BmiAANAT)序列突變?cè)斐?，突變基因編碼的芳烷基乙酰轉(zhuǎn)移酶(AANAT)失去了催化多巴胺形成N-乙?；喟桶返墓δ?，致使多巴胺生成過(guò)量的黑色素，并隨著表皮鞣化使暗化型家蠶幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)呈現(xiàn)出黑化現(xiàn)象[3-4]；而正常型家蠶中催化多巴胺形成N-乙?；喟桶返墓δ苤饕苫駼miAANAT與BmiAANAT2編碼的酶來(lái)共同承擔(dān)[5]。

暗化型家蠶被發(fā)現(xiàn)以后，安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所家蠶育種組的工作人員率先將突變的BmiAANAT基因?qū)氲骄哂袃?yōu)良性狀的實(shí)用品種中，利用暗化型家蠶成蟲(chóng)體色灰黑的特點(diǎn)，培育出黑白分明的雙親，把家蠶一代雜交種雜交率提高到99%以上，并組配了517(暗化型)×518及四元雜交種皖廣三號(hào)(日系574、576為暗化型)等一系列家蠶雜交組合[6-9]。而且在品種培育過(guò)程中，工作人員發(fā)現(xiàn)暗化型品系580分離出了幼蟲(chóng)期頭、胸足等骨化部位和蛹期后期、蛾期等發(fā)育階段體色均比正常暗化型家蠶著色較淺的群體，為了便于區(qū)分，這些著色較淺的暗化型家蠶被命名為淺580。580與淺580家蠶個(gè)體除在著色上有差別以外，在蟲(chóng)體形態(tài)、眠起時(shí)間、蟲(chóng)蛹率等生理方面并沒(méi)有差別。我們對(duì)家蠶品系淺580做遺傳調(diào)查后發(fā)現(xiàn)：淺暗化蛾與正常白蛾雜交的F1代全部為正常白蛾，F(xiàn)2、BC1代正常白蛾與淺暗化蛾的分離比分別為3∶1和1∶1；淺暗化蛾自交的后代全部為淺暗化表型，表明淺暗化突變?yōu)殡[性。

雖然暗化型家蠶的突變基因已被定位，黑色素合成代謝途徑上的大部分基因也已經(jīng)被解析，但暗化型家蠶的調(diào)控機(jī)制和對(duì)家蠶抗性方面的影響仍有不少未解之處[10]。淺580作為天然著色較淺的暗化型品系是研究家蠶暗化突變發(fā)生及調(diào)控機(jī)制的優(yōu)良素材，對(duì)其發(fā)生原因的解析能進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)暗化突變機(jī)制的認(rèn)識(shí)。本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上采用克隆基因全長(zhǎng)序列和測(cè)定基因相對(duì)表達(dá)量的方式分析了BmiAANAT和BmiAANAT2與淺暗化型家蠶形成的關(guān)系，進(jìn)而探究淺580的發(fā)生機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試家蠶 暗化型家蠶品系580、淺暗化型家蠶品系淺580，均由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所家蠶育種組培育并飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime Script II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，6210B)、DNA Mark、熒光定量PCR試劑盒[TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)，RR420A]，均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；RNA提取試劑(Trizol Reagent)、瓊脂糖B(A600014)，均為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 Lightcycle K型熒光定量PCR儀，杭州BIOER公司產(chǎn)品；Allegra 21R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)BECKMAN公司產(chǎn)品；SIM-F140AY65型雪花狀制冰機(jī)，日本SANYO公司產(chǎn)品；Hofer MV-25型紫外透射儀，美國(guó)Amersham Pharmacia公司產(chǎn)品；2.5 μL、10.0 μL、100.0 μL、1 000.0 μL規(guī)格的移液器，均為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 家蠶暗化型突變體黑化程度的觀察與比較 分別在幼蟲(chóng)期5齡第4天、蛹期末期、蛾期等發(fā)育階段對(duì)家蠶品系580和淺580進(jìn)行觀察，并比較2個(gè)家蠶品系在各時(shí)期、各部位的黑化程度和著色深淺。

1.2.2 家蠶暗化相關(guān)基因BmiAANAT和BmiAANAT2的克隆分析 (1)“Trizol法”提取家蠶樣品總RNA。家蠶品系580和淺580幼蟲(chóng)飼養(yǎng)到5齡第4天，分別隨機(jī)挑選5頭放入經(jīng)過(guò)180 ℃高溫烘干處理3 h的研缽內(nèi)，加入液氮快速將材料研磨成粉末狀，并稱(chēng)取100 mg加入1 mL Trizol Reagent后震蕩混均，然后靜置10 min使材料充分裂解。隨后依照Trizol Reagent 試劑說(shuō)明書(shū)步驟操作提取總RNA，提取的RNA樣品用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整度，測(cè)定A260/A280、A260/A230的比值及濃度，最后將檢測(cè)合格的樣品總RNA于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?2)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。合成cDNA時(shí)使用寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，依照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。cDNA提取完成后，對(duì)樣品濃度進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專(zhuān)约倚Q看家基因Actin3作為cDNA質(zhì)量的檢測(cè)基因。經(jīng)檢驗(yàn)合格的cDNA及時(shí)放入-20 ℃冰箱保存。(3)克隆分析。以暗化突變基因BmiAANAT(GenBank登錄號(hào)：DQ256382.1)和BmiAANAT2(GenBank登錄號(hào)：AK383501)全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物(引物序列見(jiàn)表1)，來(lái)擴(kuò)增2樣品的暗化相關(guān)基因BmiAANAT和BmiAANAT2。PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積50 μL，擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，45 ℃ 2 min，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束控制在4 ℃，PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。把擴(kuò)增的目的條帶切下送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，測(cè)序的結(jié)果與基因BmiAANAT的突變類(lèi)型1(GenBank登錄號(hào)：GQ169236.1)、突變類(lèi)型2(GenBank登錄號(hào)：GQ169237.1)以及基因BmiAANAT2的全長(zhǎng)序列進(jìn)行分析比較。

表1擴(kuò)增暗化基因BmiAANAT和BmiAANAT2全長(zhǎng)的引物序列

引物名稱(chēng)上游引物(5′-3′)下游引物(5′-3′)BmiAGCGACACGGTCCCACGAACGATTCATTCAGACAACAACGATACBmiA2TGCTCGGCTCAAGGAGCGAGTTGTTTAACCGTGTTAAATATTTAT

1.2.3 家蠶暗化相關(guān)基因BmiAANAT和BmiAANAT2相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定 (1)“Trizol法”提取家蠶樣品總RNA。在蛹期第7 天隨機(jī)挑選家蠶品系580和淺580各5頭為試驗(yàn)材料，依照1.2.2(1)“Trizol法”提取家蠶樣品總RNA項(xiàng)的方法和操作步驟分別提取總RNA。提取的樣品總RNA經(jīng)檢驗(yàn)合格后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?2) RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA及熒光定量PCR?；蚪MDNA去除、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA及熒光定量PCR均依照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。根據(jù)基因BmiAANAT和BmiAANAT2的序列設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)熒光定量PCR引物和內(nèi)參引物sw22934(表2)，并委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法[11]進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定與分析。

表2暗化型相關(guān)基因BmiAANAT、BmiAANAT2和內(nèi)參基因熒光定量PCR引物序列

引物名稱(chēng)上游引物(5′-3′)下游引物(5′-3′)(熒光標(biāo)記)BmiATGAATCTCGCCGTCAATCTGGAAACTCCATCGCTCAAGGTAGBmiA2GTCTTTCAAAGCCGTCGAGTTTAGGATTGGGACATCGAAsw22934TTCGTACTGCTCTTCTCGTCAAAGTTGATAGCAATTCCCT

2 結(jié)果與分析

2.1 580及淺580黑化程度的觀察與比較

對(duì)家蠶品系580及淺580幼蟲(chóng)期5齡第4天、蛹期末期、蛾期等發(fā)育階段的觀察發(fā)現(xiàn)，2個(gè)家蠶品系的黑化程度在各發(fā)育階段均有明顯的差異：幼蟲(chóng)期，580品系幼蟲(chóng)的頭、尾板等骨化部位是黑褐色，而淺580品系骨化部位的顏色為淡褐色(圖1-A)；蛹期末期，復(fù)眼剛著色時(shí)580品系蠶蛹的頭、胸部已經(jīng)有大量黑色素聚集沉淀，呈深黑色，而淺580品系蠶蛹上半部為淡黑色(圖1-B)；蛾期，580品系雌、雄蛾全身為灰黑色，且一般雄蛾顏色較淺，但都比淺580品系的顏色深(圖1-C)。這表明家蠶品系淺580的個(gè)體表皮聚集的黑色素含量比580的個(gè)體低。

A. 5齡第4天，B. 蛹期末期，C. 蛾期；紅色箭頭所示為各發(fā)育階段的家蠶暗化型品系580。圖1 幼蟲(chóng)期、蛹期、蛾期等發(fā)育階段家蠶品系580與淺580的著色情況對(duì)比圖

2.2 暗化相關(guān)基因BmiAANAT與BmiAANAT2的克隆與分析比較

如圖2-A所示為擴(kuò)增家蠶品系580與淺580暗化突變基因BmiAANAT全長(zhǎng)序列的電泳圖，在圖中2個(gè)樣品均擴(kuò)增出了2條電泳帶，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)的電泳帶所含DNA堿基序列相同：下面亮度較暗的1條，均含有1 253 bp堿基序列，與BmiAANAT突變類(lèi)型1序列一致；上面亮度較高的1條，都含有1 407 bp堿基序列，且和BmiAANAT突變類(lèi)型2序列相同。圖2-B是擴(kuò)增家蠶品系580與淺580的BmiAANAT2全長(zhǎng)序列的電泳圖，圖中2個(gè)樣品均擴(kuò)增出單一電泳帶，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)這2條電泳帶所含DNA堿基序列也相同。這表明家蠶品系580與淺580在暗化突變基因BmiAANAT突變類(lèi)型方面是相同的，2個(gè)家蠶品系的BmiAANAT2也沒(méi)有產(chǎn)生堿基序列突變；同時(shí)也說(shuō)明淺580品系的淺暗化型表型不是由這2個(gè)基因的堿基序列突變?cè)斐傻摹?/p>

A. 基因BmiAANAT，B. 基因BmiAANAT2。圖2 擴(kuò)增家蠶品系580與淺580暗化相關(guān)基因BmiAANAT和BmiAANAT2全長(zhǎng)序列電泳圖

2.3 暗化相關(guān)基因BmiAANAT和BmiAANAT2相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定與分析

圖3所示為家蠶品系580與淺580暗化相關(guān)基因BmiAANAT和BmiAANAT2在蛹期第7天的相對(duì)表達(dá)量。在圖3-A中，家蠶品系580暗化突變基因BmiAANAT的相對(duì)表達(dá)量約是家蠶品系淺580的8.3倍；如圖3-B，家蠶品系580暗化突變基因BmiAANAT2的相對(duì)表達(dá)量也達(dá)到了家蠶品系淺580相對(duì)表達(dá)量的3.0倍。2個(gè)家蠶品系間，暗化突變基因BmiAANAT和BmiAANAT2的相對(duì)表達(dá)量均存在極顯著的差異，且家蠶品系580的2個(gè)暗化突變基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)。推測(cè)BmiAANAT和BmiAANAT2的差異表達(dá)與家蠶品系淺580的形成有一定的內(nèi)在聯(lián)系。

A. 基因BmiAANAT的相對(duì)表達(dá)量，B. 基因BmiAANAT2的相對(duì)表達(dá)量；圖中數(shù)據(jù)為平均值，**表示2個(gè)家蠶品系間基因BmiAANAT的表達(dá)量存在極顯著差異(t檢驗(yàn)，P<0.01)。圖3 家蠶品系580與淺580暗化相關(guān)基因BmiAANAT和BmiAANAT2在蛹期第7天的相對(duì)表達(dá)量

3 小結(jié)與討論

早在1961年就有了暗化型家蠶的報(bào)道[12]，從那時(shí)起科研人員對(duì)它的研究就沒(méi)有停止過(guò)。TSUGEHARA等[13-14]克隆了基因BmiAANAT的cDNA全長(zhǎng)序列，進(jìn)一步研究表明其表達(dá)產(chǎn)物可以是乙?；喟桶?、色胺、酪胺、真蛸胺等多種物質(zhì)，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)BmiAANAT的突變與暗化型家蠶之間的關(guān)聯(lián)。直到中國(guó)科學(xué)院的詹帥等[15]和西南大學(xué)的代方銀等[4]分別通過(guò)各自的研究把家蠶暗化突變基因確定為BmiAANAT基因才解析了暗化型家蠶的發(fā)生原因。朱勇等通過(guò)進(jìn)一步研究在家蠶中鑒定出了另1條AANAT基因，將其命名為BmiAANAT2，并通過(guò)基因敲除技術(shù)證實(shí)該基因編碼的酶也具有催化多巴胺形成N-乙酰基多巴胺的功能[5]。

基因BmiAANAT與BmiAANAT2編碼的酶相似度高達(dá)57%，其共同的催化底物多巴胺是家蠶表皮硬化及黑色素代謝過(guò)程中的一種關(guān)鍵物質(zhì)[5]。多巴胺由酪氨酸經(jīng)酪氨酸羥化酶(TH)作用生成多巴(dopa)，再經(jīng)多巴脫羧酶(DDC)的作用生成[16]，其在家蠶黑色素合成代謝途徑上主要有3個(gè)去向：一是在N-β-丙酰多巴胺合成酶(NBAD synthase)的作用下與β-丙氨酸形成N-β-丙酰多巴胺(NBAD)，最后合成黃褐色的色素，NBAD在酶的水解作用下能分解成多巴胺和β-丙氨酸；二是在AANAT的作用下轉(zhuǎn)化為N-乙?；喟桶?NADA)，NADA繼續(xù)合成無(wú)色或透明的色素；三是在一系列酶的催化作用下生成深棕色的多巴胺黑色素[17-19]。BmiAANAT發(fā)生基因突變，編碼無(wú)催化功能的AANAT從而使第2條途徑受阻就是暗化型家蠶的發(fā)生原因。

本研究通過(guò)克隆基因BmiAANAT和BmiAANAT2的全長(zhǎng)序列和測(cè)定其相對(duì)表達(dá)量來(lái)分析2個(gè)基因與淺暗化型家蠶形成的關(guān)系。克隆和測(cè)序結(jié)果顯示，家蠶品系580與淺580所含BmiAANAT的突變類(lèi)型是相同的，突變后的基因堿基序列與以前的報(bào)道一致；2個(gè)家蠶品系間BmiAANAT2的堿基序列也無(wú)差異。這表明家蠶品系淺580的發(fā)生不是由BmiAANAT和BmiAANAT2堿基序列突變?cè)斐傻摹?/p>

分析熒光定量PCR相對(duì)表達(dá)量結(jié)果時(shí)發(fā)現(xiàn)，2個(gè)家蠶品系間BmiAANAT和BmiAANAT2的相對(duì)表達(dá)量都存在極顯著的差異，且家蠶品系580的2個(gè)暗化突變基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)。結(jié)合幼蟲(chóng)期5齡第4天、蛹期末期、蛾期等發(fā)育階段580的個(gè)體都表現(xiàn)出比淺580的個(gè)體黑化程度更深的表型特征，可以推斷家蠶品系580個(gè)體內(nèi)的黑色素含量要明顯高于家蠶品系淺580的個(gè)體，且家蠶品系580個(gè)體內(nèi)黑色素的前導(dǎo)物多巴胺含量也應(yīng)該高于家蠶品系淺580。淺580個(gè)體內(nèi)含量較低的多巴胺誘導(dǎo)BmiAANAT，BmiAANAT2的表達(dá)量大幅下調(diào)，生成的多巴胺黑色素也明顯下降，從而表現(xiàn)出淺暗化表型；但多巴胺含量偏低是由黑色素代謝通路上游的TH及DDC活性降低引起的，還是由通路下游的NBAD 合成酶的過(guò)量表達(dá)引起的，以及具體的調(diào)控機(jī)理都還需要進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。