朱慧 劉忠泉 謝莉 郭少晨 王彬 付雷 陸宇

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(MTB)引發(fā)的慢性傳染病，在全球范圍廣泛流行，嚴重危害人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)[1]2017年全球結(jié)核病報告，2016年世界范圍內(nèi)約有1040萬例新發(fā)患者，估算全球耐多藥和單耐利福平結(jié)核病患者約60萬例，其中耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)約占82%。2016年結(jié)核病仍然排在全部死亡原因中的前10位，約有167萬例死于結(jié)核病[1]。WHO估算2016年中國約有新發(fā)結(jié)核病患者89.5萬例，現(xiàn)有抗結(jié)核藥物不能滿足臨床治療需求，新型抗結(jié)核藥物的開發(fā)迫在眉睫。

貝達喹啉是首個被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準上市的治療MDR-TB的藥物。2016年12月，貝達喹啉在中國被批準上市。鑒于貝達喹啉有心臟QT間期延長等不良反應，WHO指南建議加強治療期間藥物不良反應檢測和監(jiān)管，防止貝達喹啉濫用及耐藥性的產(chǎn)生[2-3]。對抗結(jié)核藥物進行血藥濃度監(jiān)測(therapeutic drug monitoring，TDM)，是指導臨床個體化給藥的較好手段，對觀察藥物相互作用、減少藥物不良反應方面有著積極的作用[4-5]。關(guān)于貝達喹啉血藥濃度的檢測方法僅有國外的一篇報道，國內(nèi)尚無相關(guān)報道[6]。本文針對貝達喹啉建立了快速、準確的高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS) 檢測方法，檢測臨床服用貝達喹啉患者的血藥濃度，以便及時了解患者服藥后的狀況，給醫(yī)生提供用藥指導，從而達到提高療效、降低不良反應的目的。

材料和方法

一、儀器與試劑

1200 型高效液相色譜系統(tǒng)購自美國Agilent 公司， 配備電噴霧(ESI) 離子源的G6410B 型三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀, 其他設(shè)備還包括Milli Q 純水機，Mettler Teledo XS 105 型 1/10萬分析天平等。貝達喹啉(上海瀚香生物科技有限公司，產(chǎn)品批號20150317)；甲醇(美國Fisher 公司), 色譜純(產(chǎn)品批號086535)； 甲酸(分析純)； 水為去離子水。

二、方法

1. 對照品溶液的配制：精密稱取貝達喹啉10 mg, 溶于甲醇中配制成2 mg/ml 的儲備液，置-80 ℃冰箱內(nèi)保存, 使用時稀釋至所需濃度。

2. 高效液相色譜條件：分析柱為Agilent ZORBAX SB-C18(2.1 mm×100 mm, 3.5 μm)； 柱溫為 25 ℃； 流動相: 甲醇-水(含0.1% 甲酸, 5 mmol/L甲酸胺) (85∶15)； 流率: 0.3 ml/min；進樣量2 μl。樣品分析時間為3.0 min。

3. 質(zhì)譜條件：離子化方式為電噴霧電離；離子極性為正離子；檢測方式采用多反應監(jiān)測， 母離子和子離子分別為質(zhì)荷比(m/z)555.2→58.3；質(zhì)譜參數(shù)如下：毛細管電噴霧電壓(capillary) 為4 kV, 去溶劑氣溫度為 350 ℃，去溶劑氣體流率為10 L/min， 碰撞能(collision energy) 為80 eV。

4. 樣品處理方法及質(zhì)控樣制備：健康人空白血漿室溫解凍后, 精密量取90 μl, 加入貝達喹啉對照品儲備液至總體積100 μl，制成終濃度0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/ml的含藥血漿。旋渦混勻后加入乙腈溶液200 μl，旋渦振蕩混勻后，4 ℃，離心力13 800×g離心10 min，取上清液置于進樣瓶中，進樣2 μl 檢測。采用同樣的方法每日配制濃度為0.2、1.0、4.0 μg/ml的貝達喹啉含藥血漿各5份，連續(xù)3 d，作為低、中、高濃度的質(zhì)量控制樣品，用以考察方法學的各項指標。

5. 樣品穩(wěn)定性考察：(1) 室溫放置穩(wěn)定性考察，取低、中、高濃度樣品(0.2、1.0、4.0 μg/ml)各3份, 室溫下放置4 h 后, 按方法項4處理、檢測。(2)凍融穩(wěn)定性考察，取低、中、高濃度樣品(0.2、1.0、4.0 μg/ml), 凍存于-80 ℃冰箱內(nèi), 取出后室溫自然解凍； 再冷凍12～24 h, 重復循環(huán)2次, 得到3次凍融樣品, 按方法項4處理、檢測。(3)處理后樣品放置穩(wěn)定性考察，取低、中、高濃度樣品(0.2、1.0、4.0 μg/ml)，按方法項4處理后, 室溫放置4 h 后再次檢測， 4 ℃放置24 h后再次檢測。(4)長期凍存穩(wěn)定性考察，取低、中、高濃度樣品(0.2、1.0、4.0 μg/ml)，-80 ℃冰箱內(nèi)保存1周，2周后按方法項4加入乙腈沉淀蛋白后離心，取上清進行檢測。

三、結(jié)核病患者血樣采集及前處理

對已入組“中國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會-比爾及梅琳達·蓋茨基金會結(jié)核病防治合作項目”的12例結(jié)核病患者進行血藥濃度檢測，患者來源于北京胸科醫(yī)院，服用貝達喹啉的劑量均為2周內(nèi)，每日1次，每次400 mg；2周后，1周3次，每次200 mg，口服。簽署知情同意書后，患者于服藥5 h后采集靜脈血2 ml(峰濃度)，服藥前采集靜脈血2 ml(谷濃度)，兩種劑量各采集峰濃度和谷濃度血樣一次。血樣在4 ℃條件下，1348×g離心15 min，取上清100 μl 加入乙腈溶液200 μl；旋渦振蕩混勻后，在4 ℃ 條件下，13 800×g離心10 min，取上清液置于進樣瓶中，進樣2 μl 檢測。

結(jié) 果

一、檢測方法的特異性

空白血漿加入對照品的色譜圖見圖1。在本研究的測定條件下，采用高效LC-MS/MS聯(lián)用方法分析人血漿中貝達喹啉的濃度，其出峰時間為1.9 min 左右，6份人空白血漿來源于6名健康志愿者。圖1顯示，在貝達喹啉出峰處沒有吸收峰，說明空白血漿中沒有雜質(zhì)對貝達喹啉的分離測定造成干擾。貝達喹啉分子結(jié)構(gòu)及定量子離子結(jié)構(gòu)見圖2， 母離子和定量子離子為m/z555.2→58.3。

二、標準曲線的建立

按照方法項4，配制標準曲線樣品。以藥物濃度(X)為橫坐標, 藥物峰面積(Y)為縱坐標, 進行加權(quán)回歸, 得回歸方程, 繪制標準曲線?？疾? d 內(nèi)3條標準曲線，r均大于0.99， 1/X加權(quán)。貝達喹啉典型標準曲線方程為：

Y=166 617.845 806X-340.413 190r=0.998

在0.1～5.0 μg/mlY與X呈良好線性關(guān)系。

三、 HPLC-MS/MS檢測方法的精密度及準確度

相對標準偏差(RSD)=標準偏差(SD)/計算結(jié)果的算術(shù)平均值，表1中日內(nèi)精密度是5次測量結(jié)果的RSD，日間精密度是15次測量結(jié)果的RSD，準確度=測量值/理論值。取方法項4配制的低、中、高濃度的質(zhì)控樣品, 每濃度制作3個分析批，每一濃度每批5個樣品，日內(nèi)平行測定5次，計算日內(nèi)精密度；連測3 d，計算日間精密度。結(jié)果見表1。

圖1 空白血漿和含貝達喹啉(1.0 μg/ml)的血漿色譜圖

圖2 貝達喹啉的分子結(jié)構(gòu)和定量離子結(jié)構(gòu)

貝達喹啉濃度(μg/ml)精密度(%)日內(nèi)(5份)日間(15份)準確度(%)0.23.429.8697.81.01.812.23107.04.01.923.73107.0

表2 不同條件下HPLC-MS/MS檢測3種濃度貝達喹啉的穩(wěn)定性

表3 不同檢測指標采用HPLC-MS/MS檢測3種濃度貝達喹啉的效果

上述穩(wěn)定性結(jié)果見表2, 在本研究考察的各種儲存條件下, 儲存樣品的測定值與理論值之間的偏差均符合要求(RSD小于10%，則符合要求), 說明樣品在這些條件下的穩(wěn)定性良好。

四、 儲備液穩(wěn)定性

用新配制的對照品溶液配制標準曲線, 外標法考察30 d 前配制的對照品儲備液(- 80 ℃保存), RSD小于10%，準確度在±15%以內(nèi)，符合要求，說明貯備液在30 d 內(nèi)保持穩(wěn)定。

五、基質(zhì)效應

分別配制對照品低、中、高濃度(0.2、1.0、4.0 μg/ml)各3 份。分別用3種方法制備(1、2、3組)，1組用流動相加入不同濃度貝達喹啉溶液配制，2組是用空白血漿加入2 倍體積乙腈沉淀蛋白后, 離心取上清(13 800×g離心10 min，同方法項4)，再加入不同濃度貝達喹啉溶液后制得。3組是用空白血漿加入不同濃度貝達喹啉, 乙腈沉淀蛋白后, 離心取上清制得(13 800×g離心10 min，同方法項4)。將1、2、3組的響應值分別用A、B、C表示，則基質(zhì)效應=100%×B/A，萃取回收率=100%×C/B，方法效率=100%×C/A，結(jié)果見表3。

六、結(jié)核病患者血藥濃度的檢測

對12例患者穩(wěn)態(tài)后的峰濃度(服藥后5 h)和谷濃度(服藥前)進行檢測。當服用400 mg，每日一次時，峰濃度為(3.17±1.14) μg/ml(1.48～4.82 μg/ml)，谷濃度為(1.12±0.64) μg/ml(0.22～2.32 μg/ml)；當劑量為200 mg，每周3次時，峰濃度為(2.01±0.87) μg/ml(0.70～3.97 μg/ml)，谷濃度為(0.65±0.30) μg/ml(0.19～1.12 μg/ml)。

討 論

貝達喹啉是近50年來第一個上市的抗結(jié)核新藥,屬二芳基喹啉類藥物，它通過抑制結(jié)核分枝桿菌三磷酸腺苷(ATP)合成酶而發(fā)揮抗結(jié)核治療作用，尤其在MDR-TB和廣泛耐藥結(jié)核病的治療中，貝達喹啉的重要地位日益凸顯[7-10]。自2013年WHO發(fā)布貝達喹啉可用于治療MDR-TB患者的暫行策略指導方案后，至少在46個國家用于MDR-TB患者的治療，數(shù)篇報道結(jié)果顯示，含貝達喹啉的治療方案可獲得良好的療效，提高痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)率[11-14]。

2016年12月，我國國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準將富馬酸貝達喹啉片作為聯(lián)合治療的一部分，用于成人(≥18歲)耐多藥肺結(jié)核的治療。貝達喹啉可使患者QT間期延長且有肝毒性，該產(chǎn)品說明書中黑框警告，警示患者和衛(wèi)生保健專業(yè)人員該藥物可能影響心電活動，可能導致異常和潛在的致命心臟節(jié)律。WHO指南建議首劑服藥后2周進行相關(guān)監(jiān)測，此后每月監(jiān)測1次，直至1年；這就需要建立快速、便捷的檢測方法，對臨床患者的血藥濃度進行治療監(jiān)測。

貝達喹啉結(jié)構(gòu)中含有溴，早期有報道使用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法對其進行檢測[15-17]。Dou?a 等[18]用手性柱和紫外檢測器分析了貝達喹啉手性結(jié)構(gòu)。而貝達喹啉的HPLC-MS/MS檢測方法，國內(nèi)尚無報道。本實驗室配備AB 4000 QTRAP液質(zhì)聯(lián)用儀及Agilent 1200-6410B 液質(zhì)聯(lián)用儀，及多種C18分析柱，經(jīng)多次預實驗，優(yōu)化峰形及出峰時間，最終確定使用Agilent 1200-6410B液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，ZORBAX SB-C18柱用于本實驗方法學的建立，標準曲線范圍參考文獻報道。本實驗需要樣本量較少，僅100 μl血漿即可完成數(shù)次檢測，且血漿樣本使用了簡便的溶劑沉淀去蛋白法；文獻[6]中使用去離子水-乙腈和緩沖液(含乙酸銨、乙酸和三氟乙酸)作為流動相的梯度洗脫法，本研究使用了相對便宜的甲醇溶液取代乙腈，也未加入三氟乙酸，更方便經(jīng)濟；進樣量2 μl也小于文獻的5 μl；穩(wěn)定性考察進樣器室溫即可，不用10 ℃控溫。采用本色譜法測定人血漿中貝達喹啉，其出峰時間為1.9 min左右，可以快速檢測大批量樣本，適用于貝達喹啉的臨床監(jiān)測及藥代動力學研究。

“中國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會-比爾及梅琳達·蓋茨基金會結(jié)核病防治合作項目”在中國實施“抗結(jié)核新藥引入和保護機制項目”(NDIP項目)，項目在我國第一批6家醫(yī)院、第二批10家醫(yī)院使用富馬酸貝達喹啉全球捐贈項目的藥品。2018年2月24日，該項目第1例患者在北京胸科醫(yī)院納入。筆者對北京胸科醫(yī)院NDIP項目中患者貝達喹啉的血藥濃度進行了監(jiān)測，目前臨床入組12例均進行檢測，共48份標本，檢測結(jié)果均在標準曲線范圍內(nèi)，檢測方法應用良好。當每日服用貝達喹啉400 mg劑量時，5 h后血藥濃度最高可達4.82 μg/ml，谷濃度則在0.22 μg/ml～2.32 μg/ml間。由此可見，不同患者個體間差異較大，需要對臨床服用貝達喹啉的患者進行血藥濃度監(jiān)測，對血藥濃度明顯增高的患者密切關(guān)注不良反應，對血藥濃度低下的患者可建議醫(yī)生調(diào)整給藥劑量。

本研究建立了貝達喹啉單一藥物的檢測方法，后期可以通過分析貝達喹啉的常用給藥方案，建立貝達喹啉和其他抗結(jié)核藥物的聯(lián)合檢測方法，以獲取更多的信息。隨著項目納入患者例數(shù)的增多，可獲取更多樣本開展監(jiān)測，將獲得更多的數(shù)據(jù)并結(jié)合療效分析，為貝達喹啉的臨床應用提供更多的參考。

綜上所述，本研究建立了人血漿中貝達喹啉的快速、便捷的HPLC-MS/MS檢測方法，可用于臨床服用貝達喹啉的結(jié)核病患者的血藥濃度監(jiān)測及藥代動力學研究。此外，本研究也是首次報道服用貝達喹啉患者的血藥峰濃度、谷濃度，可為臨床上貝達喹啉的應用提供一定參考。

由筆者目前的研究結(jié)果來看，患者的個體差異較大，雖然目前入組患者例數(shù)不多，但年齡、性別分布有一定代表性。隨著入組患者例數(shù)的增加，方法若有不完善處，在后續(xù)試驗中應加以完善。此方法能滿足目前臨床研究的需要。