薛書生，笪 虎，吳 琪，趙鳳朝

0 引 言

肢體骨折后，骨折斷端常發(fā)生重疊，肢體短縮。如不能早期恢復(fù)肢體的長(zhǎng)度，患肢活動(dòng)受限，肌肉組織受到張力變小，易出現(xiàn)制動(dòng)性攣縮。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，行二期手術(shù)時(shí)，術(shù)中肢體將不易牽拉、延展，影響骨折斷端的復(fù)位及術(shù)后肢體功能恢復(fù)[1]。為了恢復(fù)骨折處正常對(duì)位關(guān)系，術(shù)者常需要做廣泛軟組織的松解，如骨膜剝離等。骨骼的血供受到破壞，常引起骨折愈合延遲甚至骨不連等后果[2]。在皮膚、肌肉、肌腱、筋膜等組織中，Ⅰ型膠原蛋白是最主要的膠原蛋白，其直徑粗大、具有較強(qiáng)的抗張能力[3-4]。故我們推測(cè)軟組織不易被拉伸，應(yīng)與Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的改變有密切關(guān)系。本研究選取兔后肢股部的深筋膜組織為研究對(duì)象，通過(guò)研究攣縮肌肉組織的深筋膜表達(dá)Ⅰ型膠原的變化，來(lái)分析攣縮的肌肉延展性變差的原因，為肢體骨折二期手術(shù)前行牽引、維持肢體長(zhǎng)度的處理，提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料24月齡以上健康新西蘭大白兔40只，雌雄不限，體重2.0～2.5 kg，均由南京青龍山動(dòng)物繁育場(chǎng)提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0011]；戊巴比妥鈉(上海恒瑞醫(yī)藥有限公司)；四甲基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(上?；蛏锕こ逃邢薰?；兔抗兔單抗、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記羊抗兔IgG(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)；總RNA提取(TRIzol)試劑(omga公司，美國(guó))；DNA酶消化試劑盒、反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(TaKaRa公司，日本)；熒光定量PCR分析儀(Applied-Biosytems，美國(guó))；苦味酸飽和水溶液(1.22%)(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)；天狼猩紅(Sirius Red，中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；偏振光顯微鏡(Nikon Eclipse 80i )、OLYMPUS CX41 顯微鏡、CANON DS16275 數(shù)碼相機(jī)。

1.2方法

1.2.1兔股骨重疊骨折模型的制作將每只兔的右后肢分配至實(shí)驗(yàn)組，左后肢分配至對(duì)照組。肌注麻醉兔后，人為折斷右側(cè)股骨干中段，使之完全性骨折。由于肌肉的收縮，骨折斷端自動(dòng)處于重疊短縮狀態(tài)。兔麻醉清醒后，置于籠內(nèi)自由活動(dòng)。實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物的處理方法符合國(guó)家科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》[5]。

1.2.2深筋膜組織的取材于兔股骨骨折后1個(gè)月和2個(gè)月，各自隨機(jī)選取20只兔子。耳緣靜脈注射空氣處死后，迅速切取雙后肢股部外側(cè)中段深筋膜。

1.2.3深筋膜組織的苦味酸天狼猩紅染色將切取的標(biāo)本立即置于10%甲醛固定24 h后，石蠟包埋、切片，切片厚約4 μm，繼而脫蠟至水，浸染于苦味酸天狼猩紅溶液1 h。水洗后蘇木精復(fù)染核，脫水、透明、封片，于偏振光顯微鏡下觀察。

1.2.4SP法免疫組化檢測(cè)筋膜組織中Ⅰ型膠原表達(dá)將切片脫蠟至水，PBS沖洗3 min×3次。用稀釋后的高pH脫蠟抗原修復(fù)液修復(fù)后，PBS沖洗。3%H2O2去離子水孵育10 min，PBS沖洗。滴加山羊血清工作液，室溫下孵育15 min，吸去多余液體。滴加1∶100兔源抗兔Ⅰ型膠原抗體，孵育60 min。PBS沖洗5 min×3次，滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min。PBS沖洗后，滴加辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育10 min。PBS沖洗后，以DAB顯色劑顯色。水冼后，復(fù)染、脫水、透明、封片。切片在顯微鏡下觀察，見(jiàn)Ⅰ型膠原免疫陽(yáng)性產(chǎn)物為棕黃色顆粒，位于深筋膜細(xì)胞膜外。每張切片內(nèi)任選5個(gè)視野(800×)，采用EMAL200真彩圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化陽(yáng)性染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析，測(cè)量每張切片陽(yáng)性染色的平均灰度值。

1.2.5Westernblot方法檢測(cè)Ⅰ型膠原表達(dá)2組各取20份骨折后1個(gè)月和2個(gè)月的新鮮后肢股部中段外側(cè)深筋膜，共80份，每份質(zhì)量約10 mg左右。經(jīng)蛋白裂解液裂解后，提取組織總蛋白。然后加入上緩沖液，100 ℃煮沸30 min。采用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠分離電泳(PAGE)，再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，使用封閉液封閉過(guò)夜。室溫下，使用兔抗兔一抗孵育2 h, TBST清洗3次；羊抗兔二抗孵育2 h，TBST清洗3次。最后，利用ECL顯色，曝光。采用ImageQuant TL圖像分析系統(tǒng)測(cè)定Western blot條帶A值，并與內(nèi)參照β-actin的測(cè)定值進(jìn)行比較，計(jì)算A比值，進(jìn)行半定量分析。

1.2.6RT-PCR法檢測(cè)Ⅰ型膠原的mRNA表達(dá)將2組各40份質(zhì)量約10 mg左右的新鮮兔后肢股部深筋膜在冰上的低溫條件下進(jìn)行研磨，然后分別加入0.5 mL TRIzol試劑，按TRLzol試劑說(shuō)明書進(jìn)行RNA的提取。cDNA合成參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。產(chǎn)物存于-20 ℃?zhèn)溆?。檢索NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中Ⅰ型膠原全長(zhǎng)mRNA序列，應(yīng)用Primier 5.0軟件，委托TaKaRa寶生物工程(大連)股份有限公司合成Ⅰ型膠原基因以及內(nèi)參GAPDH基因的上下游引物，引物序列為GAPDH(正向: 5′-TCACCATCTTCCAGGAGCGA-3′，下游:5′-CACAATGCCGAAGTGGTCGT-3′)；Ⅰ型膠原蛋白引物正向: 上游: 5′-GGTTACGACTTTGGTTATGA-3′，下游: 5′-GGAGGGTCTCAATCTGGTTG-3′)[6]。并用NCBI中的Blast程序進(jìn)行核酸序列相似性比較和引物特異性分析取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 1 μL為模板，采用(大連寶生物公司) 2×SYBR Premix DimerEvaser建立反應(yīng)體系，將各反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀，按下列條件擴(kuò)增：95 ℃ 30 s，然后40個(gè)循環(huán)按95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,讀板，以GADPH作為內(nèi)參照，用Light Cycler Software Ver. 4.0分析目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1深筋膜組織的天狼猩紅染色深筋膜組織經(jīng)天狼猩紅染色后，在偏振光顯微鏡下觀察，見(jiàn)深筋膜組織內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅰ型膠原呈鮮艷的猩紅色，有較強(qiáng)的雙折射光。對(duì)照組的Ⅰ型膠原纖維束有明顯的定向性，密度稍大、形態(tài)偏長(zhǎng)，而實(shí)驗(yàn)組的定向性較差，密度稍小、形態(tài)較短。見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)組骨折后1個(gè)月和2個(gè)月的Ⅰ型膠原纖維長(zhǎng)度均明顯小于對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)表1。

圖1 鏡下觀察骨折后兔深筋膜內(nèi)Ⅰ型膠原纖維表達(dá)(天狼猩紅染色 ×400)

2.2深筋膜組織的Ⅰ型膠原蛋白免疫組化染色深筋膜組織的切片經(jīng)Ⅰ型膠原免疫組化染色后，在顯微鏡下觀察，見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的中Ⅰ型膠原蛋白呈棕黃色，實(shí)驗(yàn)組的棕黃色染色明顯淺于對(duì)照組，見(jiàn)圖2。實(shí)驗(yàn)組骨折后1個(gè)月和2個(gè)月深筋膜Ⅰ型膠原蛋白免疫組化染色所產(chǎn)生的棕黃色的平均灰度值均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

組別n不同時(shí)間Ⅰ型膠原纖維長(zhǎng)度1個(gè)月2個(gè)月對(duì)照組2081.7±13.483.5±14.6實(shí)驗(yàn)組2058.3±18.551.1±16.2t值2.52.9P值<0.01<0.01

圖2 骨折后兔深筋膜內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)(免疫組化染色 ×800)

與對(duì)照組比較，*P<0.05圖3 骨折后不同時(shí)間兔深筋膜Ⅰ型膠原免疫組化染色灰度值比較

2.3Westernblot檢測(cè)Ⅰ型膠原的表達(dá)實(shí)驗(yàn)組骨折后1個(gè)月和2個(gè)月深筋膜組織中Ⅰ型膠原的表達(dá)均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

1、2：實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1個(gè)月、2個(gè)月；3、4：對(duì)照組術(shù)后1個(gè)月、2個(gè)月與對(duì)照組比較，*P<0.05圖4 Western blot法檢測(cè)骨折后深筋膜內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)比較

2.4RT-PCR法檢測(cè)深筋膜Ⅰ型膠原蛋白的mRNA表達(dá)RT-PCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組骨折后1個(gè)月和2個(gè)月的Ⅰ型膠原蛋白mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

與對(duì)照組比較，*P<0.05圖5 PCR法檢測(cè)骨折后深筋膜內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白的mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

膠原蛋白是由三條肽鏈擰成的螺旋形纖維狀大分子蛋白質(zhì)，作為一種細(xì)胞外基質(zhì)廣泛存在皮膚、肌腱、筋膜等組織中，由于這一長(zhǎng)且堅(jiān)韌的特殊構(gòu)型，使這些組織富有彈性，在保持組織整體功能方面發(fā)揮著重要生物力學(xué)作用[7]。膠原蛋白是一個(gè)有多達(dá)十余種成員的蛋白質(zhì)家族，其中Ⅰ型膠原蛋白含量最多，約占生物體膠原總量的90%。Ⅰ型膠原蛋白直徑較為粗大，主要作用是吸收和傳遞應(yīng)力，具有較強(qiáng)的抗張能力[8-9]。

在對(duì)發(fā)生四肢制動(dòng)性攣縮的骨傷患者行Ⅱ期手術(shù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)術(shù)中軟組織抗拉伸能力增加，特別是深筋膜、肌膜、肌腱等纖維結(jié)締組織發(fā)生攣縮、粘連，不易伸展，進(jìn)而影響到骨折短縮畸形的矯正及術(shù)后肢體功能的恢復(fù)。由于Ⅰ型膠原蛋白是纖維結(jié)締組織的最主要的抗張力蛋白，故本研究推測(cè)，發(fā)生制動(dòng)性攣縮的肢體軟組織抗拉伸能力增加，可能與肢體筋膜、肌膜、肌腱等組織的Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)有著密切相關(guān)性。

在本研究中，我們選取兔后肢股部的深筋膜為研究對(duì)象，右側(cè)股骨發(fā)生重疊、短縮性骨折。骨折1個(gè)月和2個(gè)月后，右后肢股部肌肉組織發(fā)生制動(dòng)性攣縮。切取右后肢股部中段外側(cè)深筋膜，并置于實(shí)驗(yàn)組，左后肢股部相應(yīng)部位的深筋膜置于對(duì)照組。天狼猩紅染色可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組的Ⅰ型膠原蛋白組成的纖維束定向性較差，并且長(zhǎng)度變短。進(jìn)行型膠原蛋白免疫組化染色，并用EMAL200真彩圖像分析系統(tǒng)分析棕黃色的灰度值；采用Western blot法檢測(cè)Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)；還采用RT-PCR法檢測(cè)型膠原蛋白mRNA的表達(dá)。以上結(jié)果提示：無(wú)論在骨折后1個(gè)月還是2個(gè)月，實(shí)驗(yàn)組深筋膜的型膠原蛋白的量及其mRNA的表達(dá)均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，即攣縮的深筋膜表達(dá)型膠原蛋白明顯減少。

本研究開(kāi)始之前，我們認(rèn)為由于Ⅰ型膠原蛋白具有較強(qiáng)的抗張能力，發(fā)生制動(dòng)性攣縮的肌肉不易被拉伸時(shí)，Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)應(yīng)該增加，而結(jié)果卻與我們之前的設(shè)想截然相反。出現(xiàn)這一個(gè)結(jié)果應(yīng)該是由于制動(dòng)導(dǎo)致肢體中Ⅰ型膠原蛋白分解代謝和合成失衡所造成的[10]。但這并未能對(duì)筋膜等軟組織延展性能下降給出一個(gè)合理解釋。經(jīng)過(guò)仔細(xì)觀察與分析，認(rèn)為在實(shí)驗(yàn)前我們混淆了組織的延展性與剛性這兩個(gè)概念。延展性，即韌性，是指組織受力時(shí)發(fā)生變形的能力；而剛性，即強(qiáng)度，是指組織在受力時(shí)抵抗變形的能力。

有研究表明，對(duì)于包括筋膜組織在內(nèi)的任何彈性材料而言，“胡克定律”和“彈性模量(E)”均能夠反映出其最基本的彈性行為方式[11]。在材料彈性限度內(nèi)，其應(yīng)力與應(yīng)變成正比例關(guān)系，即胡克定律，其比值被稱為材料的彈性模量(E)[12-13]。E=σ/ε，σ為應(yīng)力，ε為應(yīng)變。目前彈性模量作為軟組織力學(xué)性能重要參數(shù)之一，已經(jīng)得到較為廣泛的研究和測(cè)量，例如足部肌肉及肌腱等組織[16-17]。有研究顯示當(dāng)皮膚等組織中膠原蛋白含量增加時(shí)組織的韌性也相應(yīng)提高，反之，當(dāng)組織中膠原蛋白含量減小時(shí)組織的韌性也下降[11,16]。有學(xué)者研究表明彈性體韌性與彈性模量(E)成負(fù)相關(guān)關(guān)系，韌性越大的組織拉伸彈性模量越小[17-18]。由于攣縮肢體筋膜等結(jié)締組織中Ⅰ型膠原蛋白含量下降導(dǎo)致韌性下降，在韌性下降同時(shí)組織的拉伸彈性模量(E)增大。根據(jù)E=σ/ε公式，當(dāng)收到相同應(yīng)力σ(縱向牽引力)作用時(shí)，隨著組織彈性模量(E)增大，發(fā)生應(yīng)變量ε(拉伸長(zhǎng)度)將變小。因此與新鮮骨折相比，當(dāng)骨折肢體發(fā)生制動(dòng)性攣縮時(shí)，由于膠原蛋白含量減少導(dǎo)致拉伸彈性模量變大，使得軟組織難以牽拉、伸展。故而實(shí)驗(yàn)中得出的“Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)下降”的結(jié)論，與臨床上所見(jiàn)肌肉組織攣縮后延展性能下降的現(xiàn)象，是完全契合的。

發(fā)生制動(dòng)性肌肉攣縮的骨傷患者，軟組織延展性差，是多種因素共同作用的，包括皮膚、肌肉纖維、肌膜、肌內(nèi)膜、肌腱組織的因素，還有其他組織成分表達(dá)改變的因素[19]。本研究只單純檢測(cè)了深筋膜組織中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的改變，沒(méi)有對(duì)作用力大小、組織拉伸度等具體量化，具有顯著的局限性，是本研究不足之處，有待于我們進(jìn)一步研究。

綜上所述，肌肉組織在發(fā)生制動(dòng)性萎縮時(shí)，由于Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)變小導(dǎo)致組織彈性模量增加，延展性下降，導(dǎo)致術(shù)中肌肉組織不易于被牽拉、伸展。這為臨床工作中對(duì)于不能早期手術(shù)的肢體骨折患者，進(jìn)行適當(dāng)牽引，盡量維持肢體長(zhǎng)度，減輕肢體攣縮程度，降低Ⅱ期手術(shù)難度和減小手術(shù)創(chuàng)傷提供了理論依據(jù)。

(致謝: 感謝解放軍第八二醫(yī)院王連麗老師以及南京總醫(yī)院馬恒輝、張明超老師對(duì)本實(shí)驗(yàn)提供的幫助。)