徐正軍，邱 冬，董永毅，吳 瑛，李 瑛，王相子，徐小艷，開 妍，蔣彩霞

（1.江蘇省動物疫病預防控制中心，江蘇南京 210036；2.南京農(nóng)業(yè)大學，江蘇南京 210095；3.鎮(zhèn)江市動物疫病預防控制中心，江蘇鎮(zhèn)江 212009；4.句容市馬里農(nóng)業(yè)生態(tài)園，江蘇句容 212403）

禽流感（Avian influenza，AI）是由A型流感病毒引起的一種人獸共患病，分為高致病性禽流感、低致病性禽流感和無致病性禽流感。其中高致病性禽流感是以禽類呼吸系統(tǒng)疾病、產(chǎn)蛋下降乃至急性致死和高死亡率等為特征的烈性傳染病，不僅給養(yǎng)禽業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失，還可以導致人類感染死亡，嚴重威脅人類健康[1]，因此世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為須通報動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。免疫是防控該病的主要措施[2]。但禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）最顯著的生物學特征是亞型眾多。依據(jù)其表面的血凝素可分成16個亞型（H1～H16），依據(jù)神經(jīng)氨酸酶可分成9個亞型（N1～N9）[3]。AIV變異頻繁，不同亞型毒株之間極易通過基因互換而轉(zhuǎn)變生成新的亞型，相同亞型毒株在增殖復制過程中也會發(fā)生基因漂移而產(chǎn)生新的變異株。AIV不同亞型之間以及相同亞型的不同變異株之間均存在較大抗原差異，交叉保護力水平低[4]。據(jù)有關監(jiān)測，在我國，HA亞型除H5、H7、H9外，還有H1、H3、H4、H6、H8、H10、H11等，NA亞型除N1、N2、N9外，還有N3、N4、N6、N8等[5]，其中對家禽危害較大的H5亞型有2.3.2和2.3.4.4等多個變異分支。單一疫苗很難形成對多種AIV的有效保護，這給AI防控造成了極大困難，因此必須根據(jù)AIV變異情況及時調(diào)整使用有針對性的疫苗毒株。

2017年，由于H7N9病毒變異[6]，農(nóng)業(yè)部要求啟用新型重組禽流感病毒（H5+H7）二價滅活疫苗免疫[7]，包含H5N1亞型Re-8株和H7N9流感病毒Re-1株等2個疫苗毒株。該疫苗最初設計用于雞的免疫，對于鵝等其他動物的免疫特性未進行測試研究。但鵝對AIV也較敏感，近年來發(fā)生了多起引起鵝發(fā)病死亡的AI疫情。同時，鵝也是AI防控的關鍵環(huán)節(jié)。據(jù)監(jiān)測顯示，鵝感染率高達2.84%，且存在多種亞型的AIV混合感染；鵝感染AIV后也表現(xiàn)大量發(fā)病和死亡，還可以作為貯存宿主和混合器[8]，在AIV傳播和變異中發(fā)揮著重要作用，因此實施鵝的AI免疫具有重要意義。為摸清疫苗對鵝的AI免疫效果，進行了新型重組禽流感病毒（H5+H7）二價滅活疫苗鵝免疫試驗。

1 材料

1.1 試驗用鵝

試驗用鵝（四季鵝）100只，27日齡，臨床健康，由句容市馬里農(nóng)業(yè)生態(tài)園提供。試驗前先采集血清和雙拭子樣品進行AIV檢測和母源抗體檢測。

1.2 疫苗

新型重組禽流感病毒（H5+H7）二價滅活疫苗：句容市動物疫病預防控制中心提供，肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司生產(chǎn)，批號01721089，生產(chǎn)日期為2017年8月27日。

1.3 檢測試劑

禽流感病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒：深圳市生科源技術有限公司提供；H5亞型禽流感病毒（Re-8株）血凝及血凝抑制抗原、H7N9亞型流感病毒血凝及血凝抑制抗原以及相應的標準陰陽性血清：哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司提供。

2 方法

2.1 試驗分組

將100只試驗鵝隨機分成3組：一免組40只，依照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部推薦程序[7]，于27日齡進行1次頸部皮下免疫注射，0.5 mL/只；二免組40只，分別于27日齡、48日齡（一免后21 d）進行2次頸部皮下免疫注射，首免0.5 mL/只，二免1.5 mL/只；對照組20只，不免疫。

2.2 采樣方案

分別于免疫前（0 d）和一免后21、28、60 d進行采樣。對照組每次同步采集血清和拭子樣品10份，一免組和二免組每次采集血清樣品20份。

2.3 檢測與判定

對拭子樣品，應用熒光RT-PCR方法進行禽流感病毒（通用）檢測，CT≤40判為陽性。

對血清樣品，應用HA/HI方法，分別進行H5亞型禽流感病毒抗體和H7N9流感病毒抗體檢測，依據(jù)《2017年國家動物疫病監(jiān)測與流行病學計劃》，HI≥4 log2判為免疫合格[9]。

2.4 統(tǒng)計分析

應用GraphPad Prism 5軟件，分別對H5（Re-8株）抗體滴度和H7N9抗體滴度，繪制均值和95%置信區(qū)間的折線圖，對一免組和二免組進行t檢驗差異分析。

3 結(jié)果

3.1 AIV檢測

對免疫后0、21、28、60 d的拭子樣品40份，經(jīng)禽流感病毒（通用）熒光RT-PCR檢測，結(jié)果均為陰性，表明試驗鵝無AIV感染。

3.2 H5亞型AIV（Re-8株）抗體檢測

對照組免疫后0、21、28和60 d，H5（Re-8株）抗體合格率和平均滴度均呈下降趨勢。一免組免疫后0、21、28和60 d，H5（Re-8株）抗體合格率呈上升趨勢，平均滴度在0～28 d呈上升趨勢，60 d后開始下降。二免組一免后21、28和60 d（分別對應二免后0、7和39 d），H5（Re-8株）抗體合格率和平均滴度均呈上升趨勢；與一免組比較，二免組28、60 d的平均滴度均高于一免組，但28 d的95%置信區(qū)間與一免組存在交叉重疊，差異不顯著（P＞0.05），60 d的95%置信區(qū)間與一免組無交叉重疊，差異極顯著（P＜0.01）。具體結(jié)果見表1、圖1。

3.3 H7N9流感病毒抗體檢測

對照組免疫后0、21、28和60 d，H7N9抗體合格率和平均滴度均呈下降趨勢。一免組免疫后0～28 d內(nèi)呈上升趨勢，60 d后開始下降。二免組免疫后21、28和60 d，H7N9抗體合格率和平均滴度均呈上升趨勢；與一免組比較，28、60 d的平均滴度均高于一免組，但28 d的95%置信區(qū)間與一免組存在交叉重疊，差異不顯著（P＞0.05），60 d的95%置信區(qū)間也與一免組無交叉重疊，差異極顯著（P＜0.01）。具體結(jié)果見表2、圖2。

表2 H7N9流感抗體檢測結(jié)果

圖2 H7N9抗體滴度分布變化

趙國等[10]研究表明，家養(yǎng)水禽在陸禽與野生水禽之間的流感病毒傳播上起著非常重要的媒介和放大器作用，它們既可以攜帶多種亞型的低致病性AIV，又能長期儲存陸禽來源的高致病性AIV。吳濤等[11]研究表明，水禽用禽流感滅活疫苗可以產(chǎn)生良好的免疫保護作用，并能有效阻止病毒排泄，對流感防控具有重要意義。檢測發(fā)現(xiàn)，試驗鵝免疫新型重組禽流感病毒（H5+H7）二價滅活疫苗后，一免組和二免組的H5（Re-8株）和H7N9抗體合格率均在28 d就達到了100%，均超過了國家強制免疫的群體合格率標準（70%）。試驗表明，該疫苗能夠刺激鵝產(chǎn)生有效免疫保護抗體，適用于鵝的免疫預防。

免疫后21～60 d，一免組的平均免疫滴度呈現(xiàn)先升后降趨勢，說明一次免疫的抗體持續(xù)時間較短。而二免組則持續(xù)上升，H5（Re-8株）抗體平均免疫滴度均高于一免組，且60 d的平均滴度與一免組差異極顯著（P＜0.01），說明二次免疫的抗體持續(xù)時間優(yōu)于一免組，因此建議養(yǎng)殖場實施二免。

試驗鵝在27日齡的血清抗體檢測發(fā)現(xiàn)，H5（Re-8株）抗體合格率為60%，平均滴度為3.8 log2，H7N9抗體合格率為10%，平均滴度為1 log2，均大大低于國家強制免疫的群體合格率標準，說明鵝體內(nèi)的母源抗體已大量消減，不能抵御H5亞型禽流感和H7N9流感的侵襲，因此建議鵝的首免時間為27日齡左右，有條件的養(yǎng)殖場可以通過母源抗體監(jiān)測來確定首免時間。

5 結(jié)論

本研究選擇100只27日齡四季鵝進行新型重組禽流感病毒（H5+H7）二價滅活疫苗免疫試驗，發(fā)現(xiàn)免疫后21 d，免疫鵝的H5和H7N9的抗體合格率達到了85%，60 d 達到100%，表明該疫苗對鵝具有較好的免疫保護效果；60 d以后，免疫鵝的抗體水平開始下降，表明一次免疫不能維持足夠時間的保護，需要進行二次免疫。