蔡振鴻

（廈門市思明區(qū)市政管理中心，福建廈門 361005）

野生水禽被認(rèn)為是禽流感病毒的自然儲庫，尤其是生活在濕地和水生環(huán)境中雁形目水禽（鴨、鵝和天鵝）和鸻形目濱鳥（海鷗、燕鷗和涉水鳥）[1]。除了H5N1等高致病性禽流感病毒有導(dǎo)致大規(guī)模野禽死亡的報(bào)道外，多數(shù)禽流感亞型病毒僅導(dǎo)致野禽隱性感染而不發(fā)病，野禽只作為攜帶病毒載體。在野生水禽遷徙過程中，不同來源、不同種群的野生水禽可能會混群或公用同一水域，也可能與當(dāng)?shù)氐牧豇B或家養(yǎng)水禽發(fā)生接觸，因而可以相互傳播流感病毒，導(dǎo)致禽流感病毒跨區(qū)域傳播，并可以導(dǎo)致病毒發(fā)生基因重配而變異為感染力強(qiáng)、宿主適性廣的流行毒株，存在潛在流行的可能，因此其在流感病毒傳播中的地位不容忽視。本研究在廈門市候鳥遷徙季節(jié)，采集新鮮的濱海野生水鳥糞便，進(jìn)行禽流感病毒分離鑒定，旨在初步了解本地區(qū)野生水鳥的帶毒情況及其潛在危害。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取廈門市鳥類品種聚集最多的冬春季（2—5月）及秋冬季（9—12月），在水鳥棲息的五緣灣、筼筜湖、大嶝島的濕地、灘涂等地采集新鮮野鳥糞便。

1.2 樣品保存及鑒定

用含0.2%頭孢西丁鈉、20%甘油的PBS保存樣品。樣品采集后立即置于含干冰的泡沫箱中，低溫送至中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所進(jìn)行分離鑒定。

1.3 序列拼接與分析

利用DNA Star 軟件中Seqman 進(jìn)行序列拼接，應(yīng)用MegAlign、Mega5.2軟件進(jìn)行同源性比較和進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 樣品采集及病毒分離情況

共采集新鮮野鳥糞便828份，其中冬春季450份、秋冬季378份，結(jié)果在4月份大嶝島采集的野鳥糞便中，分離到1株禽流感病毒。

2.2 病毒鑒定

雞胚接種增殖病毒，收集尿囊液，經(jīng)血凝抑制試驗(yàn)及PCR，鑒定為H2N6亞型，采用雙脫氧終止法進(jìn)行測序，將全基因序列已上傳GenBank，將其命名為A/wild bird/Fujian/24/2017（H2N6），登錄號為 MG241343～MG241350。

2.3 基因序列分析

HA基因編碼區(qū)全長均為1 689 bp，裂解位點(diǎn)位于氨基酸序列第335～342位，序列為PQIEPKGL，沒有多個連續(xù)堿性氨基酸插入，符合低致病性禽流感病毒特征；存在8個潛在糖基化 位 點(diǎn)：25NNS27、26NST28、38NVT40、179NNT181、180NTS182、300NNT302、494NGT496、553NGS555； 受體結(jié)合位點(diǎn)左側(cè)緣第236位氨基酸（相當(dāng)于H3第226位氨基酸）為Q，未發(fā)生L突變，仍為嗜禽源性分子生物特征。NA基因編碼區(qū)全長均為1 413 bp，存在9個潛在糖基化位點(diǎn)：51NET53、54NST56、62NNT64、67NFT69、70NIT72、86NLT88、146NGT148、201NAS203、402NWS404，頸部未見缺失，符合低致病性分子特征。該分離株具有M1基因的N30D、T215A突變，NS1基因的P42S突變，PB2基因的Q591H突變，與當(dāng)前在家禽中流行的H9N2、H6N6等亞型毒株內(nèi)部基因突變趨勢相似。M2特定位點(diǎn)的突變與其耐藥性相關(guān)，包括L26F、V27A、A30T、S31N、G34E、L38F，分析顯示該分離株未發(fā)生耐藥性突變。

2.4 全基因遺傳進(jìn)化分析

HA、NA、M、NS、PA、PB1、PB2、NP基因進(jìn)化樹分別見圖1～圖8。該分離株的HA與NA基因均屬于亞歐分支，與本地區(qū)同年健康家禽分離到的4株H6N6亞型比較，NA同源性為86%～87%，M同源性為90%，NS同源性為91%，PA同源性為88%，PB1同源性為87%～88%，PB2同源性為85%，NP同源性為86%～87%，表明該分離株與家禽H6N6之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。該分離株的PA、PB1、PB2、NP這4個內(nèi)部基因與廈門家禽分離株H11N3、H3N3、H9N2、H6N6同源性為84%～90%，親緣關(guān)系也較遠(yuǎn)。

圖1 HA基因進(jìn)化樹

圖2 NA基因進(jìn)化樹

圖3 M基因進(jìn)化樹

表1 分離株8個基因與Genbank上發(fā)表的序列同源性最高的毒株

圖4 NS基因進(jìn)化樹

圖5 PA基因進(jìn)化樹

圖6 PB1基因進(jìn)化樹

圖7 PB2基因進(jìn)化樹

圖8 NP基因進(jìn)化樹

該分離株的NA基因與2007—2011年香港、云南、湖南、河南等地雞、鴨、鵝中分離到的H4N6、H7N6亞型同源性大于95%，位于同一亞分支；M基因與香港、湖南、安徽等地鴨、鵝以及野生水禽中分離到的H4N8、H6N1、H6N2、H9N2、H10N9、H11N9等亞型同源性大于97%，位于同一亞分支；NS基因與香港、臺灣、湖南等地鴨、鵝以及野生水禽中分離到的 H4N8、H5N2、H7N1、H7N7、H7N9等亞型同源性大于95%，位于同一亞分支。

該分離株的NS、PA、PB1、PB2、NP這5個內(nèi)部基因與目前Genbank中的所有已知序列的比對結(jié)果顯示，親緣關(guān)系最近毒株之間的同源性關(guān)系僅為95%～96%（表1），與國內(nèi)家禽和野禽中的分離毒株均不位于同一亞分支，屬于不同基因型。

3 討論

鳥類遷徙具有一定的規(guī)律性。廈門市候鳥分為冬候鳥和夏候鳥：冬候鳥數(shù)量較多，常見的有鸕鶿、大白鷺、蒼鷺、綠翅鴨、斑嘴鴨、北紅尾鴝、蒼鷺、紅脅藍(lán)尾鴝等，大多來自西伯利亞；夏候鳥數(shù)量較少，常見的有栗喉蜂虎、巖鷺、牛背鷺、池鷺、白額燕鷗等，來自澳洲和東南亞地區(qū)。每年10月，冬候鳥南飛路過廈門，4月飛回北方繁殖；夏候鳥每年3月北飛路過廈門，10月南飛過冬。冬春季（2—5月）及秋冬季（9—12月）是廈門市鳥類品種聚集最多的季節(jié)。因此，本研究選擇該時間段采樣，并在4月份成功分離到1株H2N6亞型禽流感病毒。

本研究在828份野生水禽糞便中僅分離出1株H2N6亞型禽流感病毒，禽流感病毒檢出率僅為0.12%。國內(nèi)關(guān)于野鳥H2亞型禽流感的報(bào)道較少。除Cheng等[2]1998—2002年在我國臺灣地區(qū)野鳥中分離到了H2N3亞型，華育平等[3]2005—2006年在三江自然保護(hù)區(qū)野鳥中分離到H2N2、H2N6亞型外，未見其他報(bào)道。本研究認(rèn)為，本地區(qū)野鳥禽流感病毒分離率低于預(yù)期值，且分離到罕見亞型的原因，除了與不同年份毒株流行的情況有關(guān)外，還與該地區(qū)鳥類種類和氣候溫濕度相關(guān)。

分離株的HA 裂解位點(diǎn)序列為PQIEPKGL↓，不存在多個連續(xù)的堿性氨基酸，NA頸部無Aa缺失，符合低致病性禽流感病毒氨基酸序列特征；與致病性相關(guān)的突變位點(diǎn)存在M1基因 的N30D、T215A突變，NS1基因 的P42S突變，PB2基因的Q591H突變，與當(dāng)前家禽流行的H9N2、H6N6等毒株相似，有毒力增強(qiáng)的突變趨勢；與耐藥性相關(guān)的M2特定位點(diǎn)[4-10]均未發(fā)生耐藥性突變。

該分離株為罕見基因型，內(nèi)部基因復(fù)雜，分子生物學(xué)分析顯示為低致病性嗜禽源性毒株。目前尚未見H2N6亞型禽流感感染人的報(bào)道，但1957年人群中曾暴發(fā)H2N2亞型的大流行，危害嚴(yán)重。當(dāng)時的流行毒株是由人流感H1N1 和禽流感H2N2 病毒重組產(chǎn)生的，其中H2N2提供了HA、NA、PB1基因，可見H2亞型可以重組為感染人的高致病性毒株。該野鳥H2N6分離株雖與本地區(qū)健康家禽分離株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但與毒力相關(guān)的多個位點(diǎn)存在突變，有毒力增強(qiáng)趨勢，存在潛在危害，需持續(xù)開展監(jiān)測，做好預(yù)警。

4 結(jié)論

本研究從廈門市的828份野生水禽糞便中分離出1株H2N6亞型低致病性禽流感病毒。分析顯示，該毒株與致病性相關(guān)的突變位點(diǎn)存在部分基因突變，與當(dāng)前在家禽中流行的H9N2、H6N6等毒株相似，存在潛在的毒力增強(qiáng)趨勢，需進(jìn)一步加強(qiáng)監(jiān)測。