陳明非，譚立文，李 巍，蒼真?zhèn)?，?帥，陳 林，許志國，王承功

（大連市畜牧總站，遼寧 大連 116037）

豬偽狂犬?。≒R）是一種嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病，可感染各生長階段的豬，但感染后癥狀表現(xiàn)各異：仔豬主要表現(xiàn)神經(jīng)癥狀，發(fā)病率和死亡率高；育肥豬和后備豬以呼吸道癥狀為主，生長停滯；生產(chǎn)母豬主要表現(xiàn)繁殖障礙；成年公豬一般不表現(xiàn)明顯癥狀，但精液中可持續(xù)帶毒12 d。該病的突出特點是耐過的急性感染豬可終身潛伏帶毒而不表現(xiàn)臨床癥狀，當機體抵抗力下降時，潛伏狀態(tài)下的PRV可被激活而引發(fā)再次感染并向外散毒[1]。這種潛伏帶毒的豬是豬場最危險的傳染源，剔除此類豬對根除PR具有重要意義。目前豬場主要通過免疫PRV基因缺失苗，同時檢測豬血清中的PRV gE抗體，然后淘汰PRV gE抗體陽性豬，逐步凈化PR[2]。近年來，我國多個豬場發(fā)生的PR疫情均與種公豬精液帶毒有關(guān)[2-5]。為了解大連市種公豬精液中的PRV帶毒情況，采集種豬場的種公豬精液和對應的血清樣品以及同場經(jīng)產(chǎn)母豬的血清樣品，同步進行PRV免疫抗體、野毒感染抗體和病毒核酸檢測。

1 材料

1.1 樣品

對大連市24個種豬場的種公豬全部采樣，同場經(jīng)產(chǎn)母豬按10%比例采樣。共對108頭種公豬對應采集精液和全血，對573頭經(jīng)產(chǎn)母豬采集全血。采集的精液包括原精液和經(jīng)稀釋16～18 ℃保存不超過3 d的精液，?70 ℃保存；從全血分離血清，4 ℃保存。

1.2 主要試劑

PRV gE抗體檢測試劑盒（批號為GN301）、PRV gB抗體檢測試劑盒（批號KN364）：美國IDEXX公司生產(chǎn)；PRV核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法，批號20171130）：中山大學達安基因股份有限公司生產(chǎn)；DNA提取試劑盒（批號AK501）：寶生物工程（大連）公司提供；PR陽性病料：大連大學生命科學與技術(shù)學院免疫學實驗室確診并保存的死亡仔豬的腦組織。

1.3 主要儀器

全波長酶標儀（型號Infinite M200）：瑞士TECAN公司生產(chǎn)；熒光定量PCR儀（型號QuantStudio5）：美國Thermo Fisher科技公司生產(chǎn)；高速冷凍離心機（型號3K-15）：德國SIGMA生司生產(chǎn)； 超低溫冰箱（型號Forma906-ULTS）：美國基因公司提供。

2 方法

2.1 種豬場PR免疫情況調(diào)查

對24個種豬場采用的PR疫苗種類，種公豬和經(jīng)產(chǎn)母豬的PR免疫次數(shù)，以及豬群健康狀況進行調(diào)查。

2.2 PRV gB、gE抗體檢測

對采集的血清樣品，用ELISA方法分別檢測PRV gB、gE抗體，按照1.2中的抗體檢測試劑盒說明書操作。通過計算每個樣品的S/N值，判定是否存在PRV gB、gE抗體，對于陽性和可疑的樣品，需要進行重復檢測確認。

2.3 種公豬精液PRV 核酸提取與檢測

將采集的精液樣品于?70～37 ℃反復凍融3次，5 000 r/min離心1 min；取上清液，按1.2中的DNA提取試劑盒操作說明提取基因組DNA，延長Proteinase K的裂解時間至4 h；裂解過程在56 ℃水浴中進行，水浴時常將樣品取出進行振蕩，以加速裂解；將提取的DNA按1.2中PRV核酸檢測試劑盒說明書進行熒光PCR試驗。在PRV核酸提取與檢測過程中，以生理鹽水作為全過程的陰性質(zhì)控，以已知PR陽性病料作為全過程的陽性質(zhì)控，以含目的片段的重組質(zhì)粒作為熒光PCR反應體系的陽性質(zhì)控。在陰性質(zhì)控、陽性質(zhì)控結(jié)果滿足質(zhì)控要求的前提下，檢測樣品有典型擴增曲線且Ct值≤38時判為PRV核酸陽性，Ct值＞38或無Ct值時，判為PRV核酸陰性。

2.4 種公豬場分級及經(jīng)產(chǎn)母豬PRV gE抗體分析

根據(jù)種豬場種公豬的PRV gB、gE抗體及精液病原檢測結(jié)果，由高到低劃分出不同PR凈化等級的種公豬場，然后分析不同等級種公豬場經(jīng)產(chǎn)母豬的PRV gE抗體。

3 結(jié)果與分析

3.1 種豬場PR免疫情況

這些種豬場的種公豬和經(jīng)產(chǎn)母豬均進行過2～4次不等的PRV基因缺失活疫苗免疫，其中23個場用的是Bartha-K61株活疫苗，1個場用的是HB-98株活疫苗。目前多數(shù)豬場的母豬生產(chǎn)情況穩(wěn)定，個別場有母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎情況發(fā)生。

3.2 血清抗體檢測

3.2.1 PRV gB抗體 24個種豬場的108份種公豬血清樣品中，檢出PRV gB抗體陽性樣品77份，陽性率為71.3%；573份經(jīng)產(chǎn)母豬血清樣品中，檢出PRV gB抗體陽性樣品445份，陽性率為77.7%。種公豬和經(jīng)產(chǎn)母豬PRV gB抗體陽性率總體差異不大。

3.2.2 PRV gE抗體 24個種豬場的108份種公豬血清樣品中，檢出PRV gE抗體陽性樣品40份，陽性率為37.0%，其中15個場的陽性率為0，4個場的陽性率為100%。573份經(jīng)產(chǎn)母豬血清樣品中，檢出PRV gE抗體陽性樣品216份，陽性率為37.7%。種公豬和經(jīng)產(chǎn)母豬PRV gE抗體總體陽性率非常接近。

3.3 精液PRV 核酸檢測

108份精液樣品中，檢出PRV核酸陽性樣品3份，其對應的血清樣品PRV gE抗體檢測均為陰性。

3.4 種公豬場分級及經(jīng)產(chǎn)母豬PRV gE抗體比較

根據(jù)種公豬、經(jīng)產(chǎn)母豬檢測結(jié)果（表1），劃分為四級種公豬場。一級種公豬場：種公豬PRV gE抗體陽性率為0，gB抗體陽性率為100%，精液PRV核酸檢測全部為陰性，共計6個場，占比25%；二級種公豬場：種公豬PRV gE抗體陽性率為0，PRV gB抗體陽性率為0～100%，共計9個場，其中1個場檢出PRV核酸陽性精液樣品；三級種公豬場：PRV gE抗體陽性率為0～100%，PRV gB抗體陽性率≤100%，共計5個場，其中2個場檢出PRV核酸陽性精液樣品；四級種公豬場：種公豬PRV gE抗體、gB抗體陽性率均為100%，精液PRV核酸檢測全部為陰性，共計4個場。

各級種公豬場經(jīng)產(chǎn)母豬的平均PRV gE抗體陽性率分別為：一級場0、二級場18.8%、三級場77.5%、四級場87.8%?？梢姺N公豬與經(jīng)產(chǎn)母豬的PRV野毒感染密切相關(guān)，野毒感染在經(jīng)產(chǎn)母豬群中呈現(xiàn)放大趨勢，二、三、四級種公豬場因種公豬導致PR發(fā)生的風險在逐級加大。

表1 種公豬場分級及種公豬、經(jīng)產(chǎn)母豬檢測結(jié)果

4 討論

4.1 帶毒種公豬對豬場PRV感染的放大作用

PRV gB抗體檢測是對PRV全病毒抗體的檢測，主要用于評估PR免疫情況，而PRV gE抗體檢測主要是為了監(jiān)測PRV野毒感染。通常情況下，兩種抗體的配合檢測能綜合評估豬場的野毒感染情況和發(fā)病風險[2]。在檢測大連市種公豬和經(jīng)產(chǎn)母豬PRV兩種抗體的同時，對應檢測了種公豬精液中的PRV核酸。結(jié)果顯示，種公豬PRV gB抗體陽性率為71.3%，gE抗體陽性率為37.0%，精液PRV核酸陽性率為2.8%，表明種公豬PR總體免疫效果一般，野毒感染情況比較嚴重。但其中25%種豬場（劃分為一級種公豬場）的種公豬PRV凈化狀況很好，PRV gE抗體陽性率為0，gB抗體陽性率為100%，精液PRV核酸檢測為陰性，而且這些種豬場抽檢的經(jīng)產(chǎn)母豬PRV gE抗體全部為陰性。而二、三、四級種公豬場的種公豬均存在從低到高的PRV野毒感染率，經(jīng)產(chǎn)母豬PRV gE抗體陽性率也明顯呈現(xiàn)從低到高的變化趨勢，可見種公豬在PRV傳播、擴散中起到了關(guān)鍵性作用。帶毒種公豬通過精液將病毒傳染給母豬，感染母豬又可以將病毒垂直或水平傳播到商品豬群，帶毒商品豬則不斷擴散病毒，因此一頭帶毒種公豬，就會將PR流行范圍逐級放大[6]，導致PR大面積蔓延，從而給PR凈化帶來非常大的困難。

4.2 對種公豬精液進行PRV檢測的必要性

PRV的感染和散毒機制是急性感染→潛伏感染→激活排毒→再次感染。這一機制的循環(huán)往復，導致PRV在豬群中長期存在。PRV潛伏感染的主要部位在神經(jīng)系統(tǒng)，其次是扁桃體和肺等部位[7]。

潛伏的病毒在一定條件下被激活2～5 d后即可形成毒血癥，在豬只未出現(xiàn)臨床癥狀前即通過身體分泌物和排泄物向外散毒，因而需要在感染6～8 d以后才能檢出感染抗體[1]。成年公豬感染PRV后癥狀不明顯。我國多地從未觀察到臨床癥狀的公豬精液中檢測到PRV核酸[8-10]。本研究用熒光PCR方法對108頭種公豬精液進行PRV核酸檢測，僅在二、三級種公豬場檢出3份陽性樣品。雖然這3份精液對應的血清樣品PRV gE抗體檢測均為陰性，但種公豬所在場均存在PRV潛伏帶毒豬，因此這3頭種公豬很可能處于PRV感染早期。這種PRV gE抗體陰性、精液病原陽性的種公豬是最危險的傳染源。由于種公豬在PR凈化中起關(guān)鍵作用，建議開展PR凈化時，不但要進行PRV gE抗體檢測，還要對種公豬精液進行病原檢測，從源頭上阻斷PRV傳播。

4.3 疫苗在PR防控中的重要性

由于豬在PRV野毒感染后會同時產(chǎn)生PRV gB、gE抗體，因此PRV潛伏感染情況嚴重的豬場PRV gB抗體可能也較高，所以PR免疫效果要結(jié)合PRV gB、gE抗體以及病原檢測結(jié)果進行綜合評估。免疫效果好的種豬場，其PRV野毒感染率也較低。本檢測發(fā)現(xiàn)，一級場種公豬和經(jīng)產(chǎn)母豬PRV gB抗體陽性率分別為100%和97.6%，免疫效果較好，因此在種公豬和經(jīng)產(chǎn)母豬中均未檢出PRV隱性感染。王榮詳?shù)萚11]對規(guī)?；i場PRV野毒感染情況進行了調(diào)查，也發(fā)現(xiàn)抗體陽性率與感染率呈負相關(guān)，表明疫苗接種在PR防控中起了重要作用。自然基因缺失的PRV弱毒疫苗會與野毒競爭定植豬的隱性感染靶組織，從而阻斷野毒感染，最適用于PRV隱性感染的控制，同時弱毒疫苗誘導群體產(chǎn)生的體液免疫、細胞免疫和局部黏膜免疫能夠阻止感染豬只發(fā)病，降低排毒量，從而有效抑制病毒傳播[12]。Bartha-K61弱毒苗是自然篩選的毒力基因缺失疫苗，在大連市應用廣泛。本次檢測的24個種豬場絕大多數(shù)使用Bartha-K61弱毒苗，但是免疫效果參差不齊。今后需要以一級場為示范，在其他種豬場推廣科學的免疫接種程序和生物安全措施，同時加強監(jiān)測，逐步推進全市PR的凈化。

5 結(jié)論

本研究對大連市24個種豬場的種公豬和經(jīng)產(chǎn)母豬的血清樣品應用ELISA方法檢測PRV gE抗體、PRV gB抗體，對種公豬應用熒光PCR試驗對應檢測精液中的PRV核酸，根據(jù)檢測結(jié)果綜合評估種公豬和經(jīng)產(chǎn)母豬的PR免疫情況、PRV感染情況。檢測發(fā)現(xiàn)種公豬存在PRV gE抗體陰性、精液PRV核酸陽性的情況，且種公豬PRV感染水平與經(jīng)產(chǎn)母豬PRV感染水平呈正比放大效應。因此，PR防控與凈化的關(guān)鍵是要對種公豬嚴格管控，對其不但要進行PRV gE抗體檢測，還要進行精液PRV核酸檢測，任何一項檢測陽性的種公豬均應被淘汰，以便從精源上阻斷PRV傳播。