吳疇斌,方志明,王煒,郝名浩

廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院(解放軍第一七五醫(yī)院)腫瘤內(nèi)科,福建漳州3630000

泛素特異性蛋白酶(ubiquitin-specific protease,USP)家族是去泛素化酶家族中成員最多且結(jié)構(gòu)最具多樣性的一類.泛素特異性蛋白酶9X(ubiquitin-specific peptidase 9 X-linked,USP9X)即X染色體連鎖的泛素特異性蛋白酶,定位于X染色體p11.4位點(diǎn),基因全長150 945 bp,編碼2554個(gè)氨基酸殘基.盡管已有研究表明USP9X對(duì)部分腫瘤的進(jìn)展及預(yù)后具有一定的作用,但USP9X與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的關(guān)系目前仍不明確[1-3].本研究探討了非小細(xì)胞肺癌組織和正常肺組織中USP9X的表達(dá)情況及其臨床意義,旨在分析USP9X與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)道如下.

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2011年7月至2016年7月于廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院經(jīng)外科手術(shù)切除的95例非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本,另收集32例癌旁正常肺組織標(biāo)本作為對(duì)照.95例患者中,男76例,女19例;年齡20～80歲,>60歲46例,≤60歲49例;無吸煙史33例,有吸煙史62例;病理類型:腺癌42例,鱗癌46例,腺鱗癌7例;分化程度:中高分化64例,低分化31例;腫瘤直徑>5 cm 56例,腫瘤直徑≤5 cm 39例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例;TNM分期:Ⅰ期27例,Ⅱ期26例,Ⅲa期42例;具有化療和(或)放療指征的患者均在術(shù)后接受了以鉑類為基礎(chǔ)的雙藥化療方案,其中10例Ⅱ期患者、26例Ⅲa期患者術(shù)后接受了胸部放射治療.

1.2 檢測方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色步驟將石蠟切片置于62℃烘箱中,烘片1 min;二甲苯中脫蠟10 min,100%～30%乙醇(每種乙醇按照5%濃度下降)各5 min,然后在過氧化物酶抑制藥中浸泡10 min,除去內(nèi)源性過氧化物酶活性,然后蒸餾水沖洗3次,每次3 min后倒掉試劑,清水沖洗2次.置于pH 6.0的0.01 mol/L檸檬酸緩沖液中,加熱至沸騰(溫度最好為98～100℃),冷卻15 min,反復(fù)2次,修復(fù)過程中注意防止溫度驟冷導(dǎo)致石蠟切片在染色過程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象.取出容器,置于室溫下20 min以充分暴露固定在組織中的抗原,從緩沖液中取出切片,冷卻,蒸餾水沖洗3次.在pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)中浸泡5 min,重復(fù)2次后用蒸餾水沖洗3次.擦去組織周圍的PBS液,滴加正常羊血清封閉,37℃孵育10 min.除去羊血清液,按照1∶100的比例滴加兔抗USP9X多克隆抗體(購自Abcam公司),4℃冰箱孵育過夜.PBS沖洗3次,每次3 min.按照1∶200的比例滴加生物素標(biāo)記的二抗羊抗兔IgG,37℃孵育15～20 min,PBS沖洗3次,每次3 min.滴加過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素抗生物素蛋白,37℃孵育15～20 min,PBS沖洗3次,每次5 min.于切片上滴加3,3-二氨基聯(lián)苯胺(3,3-aminobenzidine,DAB)溶液,顯色5 min,然后用自來水、蒸餾水沖洗干凈.Harris蘇木精復(fù)染細(xì)胞核2 min,自來水沖洗.梯度酒精(70%、80%、90%、95%、100%)逐級(jí)脫水,各3 min,二甲苯透明20 min.用中性樹脂滴在組織旁邊,用蓋玻片蓋上,輕輕放平一側(cè)后再放另一側(cè),避免產(chǎn)生氣泡,封好片子后置于通風(fēng)柜中晾干.

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果分析由兩位病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行判定.根據(jù)陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分:陽性細(xì)胞百分比為1%～10%,記為0分;陽性細(xì)胞百分比為11%～50%,記為1分;陽性細(xì)胞百分比為51%～80%,記為2分;陽性細(xì)胞百分比>80%,記為3分.根據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分:未染色為0分,輕度染色為1分,中度染色為2分,重度染色為3分.根據(jù)陽性細(xì)胞百分比評(píng)分與染色強(qiáng)度評(píng)分之和,將0～3分定義為陰性表達(dá)(-),4～5分定義為弱陽性表達(dá)(+),6～7分定義為強(qiáng)陽性表達(dá)(++).將非小細(xì)胞肺癌患者分為兩組:USP9X低表達(dá)組(0～5分)和USP9X高表達(dá)組(6～7分).

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);等級(jí)資料的比較采用秩和檢驗(yàn);單因素和多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型.以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 USP 9 X在非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁正常肺組織中的表達(dá)情況

USP9X高表達(dá)主要見于細(xì)胞質(zhì)中.癌旁正常肺組織中,USP9X陰性表達(dá)僅見于基底層細(xì)胞,而在上皮棘層細(xì)胞,USP9X則呈弱陽性表達(dá)(圖1A、1B).非小細(xì)胞肺腺癌組織中,USP9X的表達(dá)呈逐層上升(圖1C、1D);非小細(xì)胞肺鱗癌組織中,這一現(xiàn)象同樣存在(圖1E、1F).非小細(xì)胞肺癌組織及癌旁正常肺組織中USP9X的表達(dá)情況比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=5.788,P<0.01)(表1).

表1 非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁正常肺組織中USP 9 X的表達(dá)情況[n(%)]

2.2 USP 9 X表達(dá)情況與非小細(xì)胞肺癌患者臨床特征的關(guān)系

有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲa期非小細(xì)胞肺癌患者的USP9X強(qiáng)陽性表達(dá)率均明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅰ～Ⅱ期的患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).不同年齡、性別、吸煙情況、病理類型、分化程度和腫瘤直徑的非小細(xì)胞肺癌患者的USP9X強(qiáng)陽性表達(dá)率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).(表2)

表2 USP 9 X強(qiáng)陽性表達(dá)率與非小細(xì)胞肺癌患者臨床特征的關(guān)系(n=95)

2.3 非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的影響因素分析

單因素分析結(jié)果顯示,非小細(xì)胞肺癌患者的生存預(yù)后可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期和USP9X表達(dá)情況有關(guān)(P<0.01).多因素分析結(jié)果顯示,TNM分期和USP9X表達(dá)情況是非小細(xì)胞肺癌患者生存預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P<0.05).(表3、表4)

表3 95例非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后影響因素的單因素分析

表4 95例非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后影響因素的多因素分析

3 討論

研究表明,USP9X在非小細(xì)胞肺癌組織中過表達(dá)[4-5].本研究結(jié)果顯示,非小細(xì)胞肺癌組織中USP9X的陽性表達(dá)率高于正常肺組織,與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致.

本研究分析了USP9X表達(dá)情況與非小細(xì)胞肺癌患者臨床特征的關(guān)系,結(jié)果表明,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲa期非小細(xì)胞肺癌患者的USP9X陽性表達(dá)率均明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅰ～Ⅱ期的患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).不同年齡、性別、吸煙情況、病理類型、分化程度和腫瘤直徑的非小細(xì)胞肺癌患者的USP9X陽性表達(dá)率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).結(jié)果提示USP9X在非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用.Peng等[6]研究表明,USP9X在食管鱗狀細(xì)胞癌患者中同樣存在過表達(dá),但不同分化程度患者的USP9X表達(dá)情況比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.147).研究顯示,不同分化程度的非小細(xì)胞肺癌患者的USP9X表達(dá)不同可能與患者的病理分型有關(guān)系[7-8].

USP9X過表達(dá)作為預(yù)后較差的因素已在部分腫瘤細(xì)胞如多發(fā)性骨髓瘤[9]、胰腺導(dǎo)管腺癌[10]中被證實(shí).本研究的多因素分析結(jié)果顯示,USP9X表達(dá)水平越高,患者的總生存期越短,USP9X的表達(dá)情況是非小細(xì)胞肺癌患者生存預(yù)后的獨(dú)立影響因素(HR=2.24,P=0.028).Peng 等[6]研究表明,在食管鱗狀細(xì)胞癌中,USP9X表達(dá)升高會(huì)致使患者的總生存期變短.Schwickart等[9]研究表明,在多發(fā)性骨髓瘤中,USP9XmRNA表達(dá)增加會(huì)導(dǎo)致腫瘤患者預(yù)后不良.而在另一項(xiàng)胰腺導(dǎo)管腺癌的研究中,USP9X蛋白低表達(dá)卻與患者的生存率呈負(fù)相關(guān),USP9X蛋白表達(dá)水平越低,預(yù)后越差[10].也許這些截然相反的結(jié)果可以解釋USP9X蛋白表達(dá)在腫瘤發(fā)生中的作用,以及在不同器官或者同一器官不同發(fā)展階段中的作用.USP9X高表達(dá)后可以調(diào)節(jié)某些基因如Mcl-1、β-catenin、TGF-β的表達(dá),從而參與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移.研究表明,在腫瘤組織中USP9X的表達(dá)會(huì)直接影響抗凋亡家族Bcl-2中Mcl-1的表達(dá),且USP9X抑制藥WP1130可以促進(jìn)Mcl-1表達(dá)下調(diào),提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性,這或許是造成USP9X具有致癌功能及導(dǎo)致腫瘤預(yù)后不良的原因[9].在淋巴瘤中,USP9X通過去泛素化的方式穩(wěn)定抗凋亡家族Bcl-2中Mcl-1的表達(dá),其結(jié)果是淋巴瘤患者的死亡率升高,進(jìn)一步研究顯示,沉默USP9X可使腫瘤增長速度減緩,但斷裂Mcl-1的48位賴氨酸多聚泛素鏈,會(huì)使Mcl-1蛋白穩(wěn)定減弱,有利于細(xì)胞生存[11].

研究發(fā)現(xiàn),USP9X在活躍細(xì)胞中能夠影響并穩(wěn)定β-catenin的表達(dá),推測其可能是通過去泛素化途徑對(duì)β-catenin起作用[12].在非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中,β-catenin的表達(dá)程度與其不良預(yù)后有關(guān),進(jìn)一步證實(shí)β-catenin是非小細(xì)胞肺癌的獨(dú)立預(yù)后因素[13].然而,造成這一現(xiàn)象是否由于非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)的USP9X使得Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化,還需進(jìn)一步研究.同時(shí),USP9X可能參與另一個(gè)與腫瘤關(guān)聯(lián)的信號(hào)通路TGF-β,無論是促進(jìn)還是抑制TGF-β信號(hào)通路,相應(yīng)的致癌基因和腫瘤抑制功能都發(fā)生改變,證實(shí)改變USP9X的表達(dá)可導(dǎo)致多種器官中TGF-β基因的改變[14].USP9X究竟是作為致癌基因還是抑癌基因,取決于腫瘤類型及分期.但對(duì)于USP9X基因表達(dá)與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制的研究卻很少.既往研究發(fā)現(xiàn),USP9X有可能作為p53的靶基因[15].除了基因表達(dá)發(fā)生改變外,USP9X被替換可通過外顯子組及再循環(huán)檢測被檢查出來.已被了解的86種腫瘤基因組學(xué)中,轉(zhuǎn)移或數(shù)量發(fā)生改變的占據(jù)53種,而在這些腫瘤中,USP9X作為唯一發(fā)生改變因素的腫瘤高達(dá)13%;USP9X表達(dá)改變的發(fā)生率在其他惡性腫瘤中更高,如在口腔鱗狀細(xì)胞癌患者樣本中就發(fā)現(xiàn)有22%[16].

綜上所述,USP9X在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)水平高于正常肺組織,TNM分期和USP9X表達(dá)情況是非小細(xì)胞肺癌患者生存預(yù)后的獨(dú)立影響因素,USP9X表達(dá)水平越高,患者預(yù)后越差.