劉東剛,白春華,張旭東

長春市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,長春1301210

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤,病死率居高不下,手術(shù)、化療及放療等治療并未一直取得實(shí)質(zhì)進(jìn)展是其重要原因,因此胃癌的病因?qū)W研究在近年來成為焦點(diǎn).相關(guān)研究表明,腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活動(dòng)異常有關(guān).磷脂肌醇3-激酶(phosphoinositide-3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又稱AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin kinase,MTOR)信號(hào)通路通過激活下游分子,對(duì)細(xì)胞的存活、生長及增殖起著中心調(diào)控作用,其中,PI3K為信號(hào)通路的重要組成分,而AKT及MTOR均為下游關(guān)鍵信號(hào)分子[1].文獻(xiàn)報(bào)道顯示,PI3K、AKT及MTOR表達(dá)異常與胃癌的發(fā)生、發(fā)展與預(yù)后密切相關(guān)[2-3].但以往研究較多集中于對(duì)單一信號(hào)分子在胃癌組織中表達(dá)情況的檢測,而PI3K、AKT及MTOR等幾種關(guān)鍵信號(hào)分子的活化形式、在表達(dá)上的相關(guān)性以及與臨床特征之間的關(guān)系,一直未予明確,尚需更多的臨床研究予以證實(shí).本研究通過采用免疫組化法及Western blot法對(duì)該通路上的下游關(guān)鍵信號(hào)分子AKT及MTOR在胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況進(jìn)行聯(lián)合檢測,并進(jìn)一步通過定量分析,探討二者在表達(dá)上的相關(guān)性以及與胃癌臨床特征的關(guān)系,為胃癌的防治提供新的思路.

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年2月至2017年2月于長春市中心醫(yī)院首次行胃癌根治術(shù)的胃癌患者的組織標(biāo)本.所有患者術(shù)后均經(jīng)病理組織學(xué)檢查,由兩位病理醫(yī)師分別獨(dú)立診斷為胃腺癌,且均為首次手術(shù)根治治療,術(shù)前未經(jīng)過任何放化療冶療的患者;根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2010年標(biāo)準(zhǔn)[4],胃癌組織學(xué)分類明確,且按美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer,AJCC)2010年第7版標(biāo)準(zhǔn)[5],均存在明確TNM分期及組織學(xué)分級(jí)的患者.共納入120例患者,男66例,女54例;年齡41～83歲,平均(52.54±5.48)歲.搜集胃癌組織標(biāo)本120例,另選取距腫瘤邊緣1 cm處的癌旁組織標(biāo)本120例及距腫瘤邊緣>5 cm處的正常胃黏膜組織標(biāo)本120例.將患者的石蠟標(biāo)本置于-80℃液氮中保存.

1.2 材料及主要試劑

材料及主要試劑包括兔抗人多克隆抗體及單克隆抗體(購自美國Cell Signaling Technology公司)、DNA裂解液(購自武漢碧云天公司)、免疫組化SP試劑盒(購自上海研卉生物公司)、DAB顯色劑(購自武漢博士德公司)以及磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)(購自南京金益柏公司)等.

1.3 免疫組化法檢測陽性細(xì)胞

使用SP法,按SP試劑盒說明書所示步驟操作.脫蠟至水,3%H2O2,低火加熱1 min,修復(fù)抗原,將一抗加入,使用PBS沖洗,再加入二抗,最后加入DAB顯色劑染色.染色時(shí),以PBS代替一抗.胃癌組織中的p-AKT及p-MTOR陽性表達(dá)均定位于細(xì)胞質(zhì).由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行獨(dú)立雙盲閱片.采用4級(jí)記分評(píng)價(jià)方法[6]判斷染色結(jié)果:以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)呈不規(guī)則棕黃色網(wǎng)狀、細(xì)顆粒狀或棕褐色團(tuán)塊狀為陽性表達(dá).按染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞比例分別記分,染色強(qiáng)度:無染色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕色為3分;根據(jù)染色細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)百分比:0～5%為0分,6～25%為1分,26～49%為2分,50～100%為3分.兩項(xiàng)相加≤1分為陰性,≥2分為陽性.

1.4 Western blot法檢測蛋白表達(dá)

從液氮罐中取出保存的新鮮胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織,加入DNA裂解液,提取總蛋白,并使用BCA法測定總蛋白濃度.將蛋白上樣于6孔板,每孔20 μg,聚丙烯胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜(nitrocellulose,NC)上,再使用封閉液(含5%脫脂奶粉)予以封閉,加入稀釋的一抗工作液,于雜交袋中過夜,使用PBS洗膜3次,每次15 min;滴加二抗,置于室溫(20℃)下孵育2 h,拍攝照片,以空白為對(duì)照,在酶標(biāo)儀上590 nm處比色,以牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo),以吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.以標(biāo)準(zhǔn)曲線空白為對(duì)照,根據(jù)樣品的吸光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的蛋白質(zhì)相對(duì)含量.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率(%)表示,-組間比較采用χ2檢驗(yàn),計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn).以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 p-AKT、p-MTOR陽性表達(dá)率的比較

采用免疫組化法檢測PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子p-AKT、p-MTOR分別在胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織3組標(biāo)本中的表達(dá)情況.在胃癌組織及正常胃黏膜組織中,p-AKT、p-MTOR均定位于細(xì)胞質(zhì)(圖1、圖2).胃癌組織中p-AKT陽性表達(dá)率為71.67%,分別高于癌旁組織(30.00%)及正常胃黏膜組織(24.17%),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);癌旁組織及正常胃黏膜組織中p-AKT陽性表達(dá)率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).胃癌組織、癌旁組織中p-MTOR陽性表達(dá)率分別為76.67%和64.00%,均高于正常胃黏膜組織(19.17%),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);胃癌組織、癌旁組織中p-MTOR陽性表達(dá)率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).(表1)

表1 p-AKT、p-MTOR在胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織中表達(dá)情況的比較[n(%)]

2.2 p-AKT、p-MTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

從120例患者中,采用Western blot法檢測p-AKT、p-MTOR分別在胃癌組織及正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況.p-AKT、p-MTOR在胃癌組織中的蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于正常胃黏膜組織,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).(圖3、表2)

2.3 p-AKT、p-MTOR表達(dá)情況與臨床特征的關(guān)系

采用免疫組化法檢測p-AKT、p-MTOR在120例胃癌組織中的陽性表達(dá)情況,結(jié)果顯示,p-AKT在低分化、TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期的胃癌組織中陽性表達(dá)率均高于高中分化、TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期的胃癌組織,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.511、18.622,P<0.05);p-MTOR在低分化、TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期的胃癌組織中陽性表達(dá)率均明顯高于高中分化、TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期的胃癌組織,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.211、7.919,P<0.01);而不同年齡、腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況胃癌患者的胃癌組織中p-AKT、p-MTOR陽性表達(dá)率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).(表3)

表2 p-AKT、p-MTOR在胃癌及正常胃黏膜組織中相對(duì)表達(dá)量的比較(±s)

表2 p-AKT、p-MTOR在胃癌及正常胃黏膜組織中相對(duì)表達(dá)量的比較(±s)

組織胃癌組織(n=120)正常胃黏膜組織(n=120)t值P值p-AKT相對(duì)表達(dá)量0.623±0.052 0.235±0.034 55.857 0.000 p-MTOR相對(duì)表達(dá)量0.561±0.021 0.331±0.042 43.809 0.000

表3 不同臨床特征的胃癌患者的胃癌組織中p-AKT、p-MTOR的表達(dá)情況(n=120)

采用Western blot法檢測p-AKT、p-MTOR在120例胃癌患者中的蛋白相對(duì)表達(dá)情況,結(jié)果顯示,p-AKT在低分化、TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期的胃癌組織中的蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于高中分化、TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期的胃癌組織,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=30.105、4.786,P<0.01);p-MTOR在低分化、TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期的胃癌組織中的蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于高中分化、TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期的胃癌組織,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.038、14.222,P<0.01);而不同年齡、腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況胃癌患者的胃癌組織中p-AKT、p-MTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).(表4)

表4 不同臨床特征的胃癌患者的胃癌組織中p-AKT、p-MTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量(n=120)

3 討論

PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路的上游關(guān)鍵信號(hào)分子PI3K在受到多種生長因子、細(xì)胞因子刺激時(shí),可被異?；罨?進(jìn)而激活其下游底物AKT,引起AKT磷酸化,繼而進(jìn)一步激活其下游底物MTOR[7].研究發(fā)現(xiàn),檢測疾病進(jìn)展的分子標(biāo)志物,從正常細(xì)胞到不典型增生再到細(xì)胞惡化,p-AKT、p-MTOR的激活水平均逐漸增加,而且伴隨凋亡分子標(biāo)志物的丟失[8].PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路在異?；顒?dòng)時(shí)存在級(jí)聯(lián)放大效應(yīng),引起PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子異常過度活化與異常活動(dòng),在加速細(xì)胞周期、抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管生成以及提高腫瘤生存能力等方面,發(fā)揮著中心調(diào)控作用[9-10],在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用.胃癌的病因較為復(fù)雜,越來越多的研究表明,胃癌的發(fā)生、發(fā)展與PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路的異?；顒?dòng)密切相關(guān)[11-12].AKT的磷酸化目前主要見于胃癌,在AKT被異常激活后,活化其下游分子底物MTOR,而MTOR通路在促進(jìn)細(xì)胞蛋白合成及有絲分裂、加速細(xì)胞周期進(jìn)程方面具有重要作用,在MTOR通路異?；顒?dòng)時(shí),可導(dǎo)致細(xì)胞周期G1期調(diào)節(jié)紊亂,胃癌細(xì)胞也具有G1期調(diào)節(jié)紊亂的顯著特點(diǎn)[13].而PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng),可能在促進(jìn)胃癌惡性進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用.

本研究中,對(duì)120例胃癌組織、120例癌旁組織及120例正常胃黏膜組織,采用免疫組化法檢測p-AKT、p-MTOR的表達(dá)情況,研究結(jié)果顯示,p-AKT、p-MTOR在胃癌組織中的陽性表達(dá)率分別高于正常胃黏膜組織,證實(shí)了p-AKT、p-MTOR在胃癌組織中存在過表達(dá),與國內(nèi)外同類研究結(jié)果[14-15]類似.將患者分別按年齡、腫瘤直徑、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度及TNM分期分組,對(duì)免疫組化檢測的結(jié)果,進(jìn)一步分析陽性表達(dá)與臨床特征的關(guān)系,結(jié)果顯示,p-AKT、p-MTOR在胃癌組織中的表達(dá)與胃癌分化程度、TNM分期有關(guān).p-AKT、p-MTOR在低分化、TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期的胃癌組織中陽性表達(dá)率及蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于高中分化、TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期的胃癌組織,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而不同年齡、腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況胃癌患者的胃癌組織中p-AKT、p-MTOR陽性表達(dá)率及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).研究結(jié)果表明,p-AKT、p-MTOR表達(dá)與胃癌的惡性進(jìn)展有關(guān).

腫瘤細(xì)胞的分化程度與細(xì)胞生理活動(dòng)紊亂的嚴(yán)重程度有關(guān),低分化腫瘤較高中分化腫瘤在細(xì)胞的生理活動(dòng)上,擁有更嚴(yán)重的紊亂程度,因此,低分化腫瘤也擁有更為嚴(yán)重的惡性發(fā)展.本研究發(fā)現(xiàn),在低分化的腫瘤組織中,p-AKT、p-MTOR存在更高表達(dá),異常活化更為活躍.推測原因,早期AKT被異常過度激活,導(dǎo)致AKT蛋白過度擴(kuò)增,AKT通過增加細(xì)胞周期素轉(zhuǎn)錄以及磷酸化蛋白激酶抑制途徑,激活下游底物,促使細(xì)胞周期加速,促進(jìn)腫瘤的惡性發(fā)展.而MTOR通過控制其下游與轉(zhuǎn)錄、翻譯有關(guān)的多種蛋白的磷酸化,在細(xì)胞的存活、生長及增殖中,起著中心調(diào)控作用.AKT激活后,位于其下游的MTOR被活化,受MTOR調(diào)控的多種生長因子、細(xì)胞因子,通過PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈而作用于細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)錄和翻譯等細(xì)胞增殖的多個(gè)重要環(huán)節(jié),兩者的級(jí)聯(lián)放大作用,共同促進(jìn)了腫瘤的惡性發(fā)展.p-AKT、p-MTOR的高度活躍,加速了細(xì)胞周期,促使受之調(diào)控的多種下游信號(hào)通路紊亂,產(chǎn)生了集中爆發(fā)效應(yīng),加重了細(xì)胞生理功能紊亂的嚴(yán)重程度,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞分化程度降低,促使細(xì)胞惡性程度增加.TNM分期及組織學(xué)分級(jí)是衡量患者惡性程度的重要標(biāo)準(zhǔn),本研究還發(fā)現(xiàn),p-AKT、p-MTOR在高臨床分期患者中,表達(dá)也隨之增高,提示p-AKT、p-MTOR在TNM分期較高的患者胃癌組織中,表達(dá)更為活躍.這一結(jié)果在其癌旁組織、正常胃黏膜組織中,也得到了體現(xiàn).而其原因可能是隨著臨床分期的升高,伴隨著細(xì)胞腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)等致癌因子及多種炎性介質(zhì)的釋放,反過來刺激PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路異?；顒?dòng)加劇,p-AKT、p-MTOR過度活化更為活躍,腫瘤在突破漿膜層后,淋巴結(jié)受累、向鄰近組織浸潤侵犯以及向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力均顯著增強(qiáng),表明腫瘤是在向惡性更高的方向發(fā)展.

本研究還發(fā)現(xiàn),p-AKT、p-MTOR在胃癌組織中的陽性表達(dá),與腫瘤直徑、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無關(guān),與以往報(bào)道的結(jié)果有所不同.晏淼等[16]報(bào)道,p-AKT、p-MTOR在胃癌組織中的表達(dá)水平,與胃癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度以及TNM分期均有關(guān).本研究以腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征單獨(dú)分組觀察,p-AKT、p-MTOR在胃癌組織中的表達(dá)比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),結(jié)果表明,p-AKT、p-MTOR表達(dá)與上述臨床特征無關(guān).提示單一臨床特征變化,并不能證實(shí)就是由p-AKT、p-MTOR異常過度活化所引起.癌癥的發(fā)生、發(fā)展有著較為復(fù)雜的原因,PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路關(guān)鍵信號(hào)分子的異?；罨?可能是胃癌發(fā)生及其臨床特征的重要原因之一,但并非是其唯一原因.但在TNM分期較高的患者中,觀察到p-AKT、p-MTOR在胃癌組織、癌旁組織及正常胃黏膜組織中均存在.

本研究結(jié)果表明,p-AKT、p-MTOR在胃癌組織中高表達(dá),證實(shí)了胃癌的發(fā)生可能與PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子過度活化后產(chǎn)生的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)有關(guān),是AKT、MTOR等多種關(guān)鍵信號(hào)分子共同促進(jìn)的結(jié)果,聯(lián)合檢測p-AKT與p-MTOR的活性物在胃癌組織中的表達(dá)情況,對(duì)于胃癌的診斷、治療及預(yù)后具有重要價(jià)值.而關(guān)鍵信號(hào)分子異?；罨脑?可能與調(diào)節(jié)PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路活性的負(fù)反饋機(jī)制即對(duì)該通路的正常抑制能力降低有關(guān),導(dǎo)致該通路的活性被過度放大,活性高度釋放,促使p-AKT、p-MTOR表達(dá)異常增多,在胃癌組織中異常高度活躍,產(chǎn)生了一系列級(jí)聯(lián)放大效應(yīng),在多種因素共同作用下,促進(jìn)了胃癌的惡性發(fā)展.宋仕茂等[17]采用雷帕素霉抑制劑干預(yù)后,發(fā)現(xiàn)可明顯抑制胃癌細(xì)胞的生長和遷移,也證實(shí)了胃癌的進(jìn)展與PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路的異?；顒?dòng)有關(guān).本研究也證實(shí),PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路有望成為新的生物治療靶點(diǎn).但該通路的異常活動(dòng),從側(cè)面證實(shí)了其活性的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制也存在著異常.因此,該生物治療靶點(diǎn)的實(shí)際臨床價(jià)值,仍尚需進(jìn)一步的臨床實(shí)驗(yàn)予以證實(shí).綜上所述,AKT、MTOR在胃癌組織中存在著過表達(dá),與胃癌進(jìn)展有密切關(guān)系.AKT、MTOR過度活化,可能與PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路的活性正常抑制能力降低有關(guān).AKT、MTOR不僅有望成為診斷胃癌惡性程度新的分子標(biāo)志物,而且在胃癌治療長期難以取得進(jìn)展,當(dāng)前手術(shù)、化療及放療等均難以取得滿意效果,針對(duì)PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路開辟生物治療途徑中,無疑具有極為重要的臨床應(yīng)用價(jià)值.