申鐵兵,郭立娜,李瓊,夏鳳君

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科,呼和浩特 0100500

口腔鱗狀細(xì)胞癌是中國(guó)目前發(fā)病率和病死率較高的頭頸部惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命.由于大多數(shù)口腔鱗狀細(xì)胞癌對(duì)放療不敏感,以及由于頜骨對(duì)放射線的阻擋,使放療效果不理想,因此,化療是口腔鱗狀細(xì)胞癌最主要的輔助治療手段[1],但是長(zhǎng)期化療易導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性,從而影響化療效果[2].因此,如何提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性一直是腫瘤治療領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn).近年來(lái),自噬性程序性細(xì)胞死亡引起越來(lái)越多細(xì)胞生物學(xué)家的關(guān)注[3].有研究顯示,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)反應(yīng)與細(xì)胞自噬密切相關(guān)[4].其中,葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔中最主要的多功能分子伴侶蛋白,參與調(diào)控未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)信號(hào)通路[5].近年來(lái),有研究表明,GRP78在一些腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá),對(duì)于腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性具有重要的影響[6],但目前關(guān)于GRP78在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況及其與化療藥物敏感性的相關(guān)性研究尚未見(jiàn)明確報(bào)道.本研究通過(guò)檢測(cè)GRP78在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平,探討其對(duì)奧沙利鉑(oxaliplatin,L-OHP)誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的影響,旨在為提高口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的化療敏感性提供潛在的干預(yù)靶點(diǎn).現(xiàn)報(bào)道如下.

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年1月至2017年12月于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科存檔的38例口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的口腔鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本作為觀察組.38例患者中,男性21例,女性17例;年齡為26～78歲,平均年齡為(57.24±13.94)歲;高分化癌15例,中分化癌17例,低分化癌6例.另外,選擇口腔頜面外科唇裂修復(fù)術(shù)中丟棄的正常口腔黏膜組織作為對(duì)照組,正常口腔黏膜組織標(biāo)本取自5例男性和5例女性,年齡為31～68歲,平均年齡為(54.50±11.07)歲.兩組標(biāo)本來(lái)源者的性別和年齡比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性.

1.2 細(xì)胞、試劑與儀器

人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Tca8113細(xì)胞購(gòu)自American Type Culture Collection公司.L-OHP由齊魯制藥有限公司提供,引物以及siRNA干擾靶序列由上海生工生物工程有限公司合成并提供,SP免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,cDNA合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒和細(xì)胞凋亡試劑盒均購(gòu)于美國(guó)OMEGA生物公司,DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基和Opti-MEM培養(yǎng)液均購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司,0.25%胰蛋白酶-EDTA細(xì)胞消化液購(gòu)于北京鈕因華信科技發(fā)展有限公司,胎牛血清和鏈霉素-青霉素雙抗均購(gòu)于美國(guó)ThermoFisher公司,Trizol和細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000均購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司,GRP78抗體、蛋白酪氨酸激酶2(Janus kinase 2,JAK2)抗體、磷酸化的蛋白酪氨酸激酶2(phosphorylated protein tyrosine kinase 2,p-JAK2)抗體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)抗體及磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3(phosphorylated signal transduction and transcription factor 3,p-STAT3)抗體均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司,辣根酶標(biāo)記的二抗購(gòu)于美國(guó)Epitomics公司,DEPC購(gòu)于美國(guó)Sigma公司,磷酸鹽緩沖液、三氯甲烷、異丙醇、無(wú)水乙醇、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,生理鹽水購(gòu)于安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司.HERcell1501型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Thermo Forma公司,Eppendorf 5427 R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Eppndorf公司,DL-CJ-2ND超凈工作臺(tái)購(gòu)于北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司,實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司,iMake多功能酶標(biāo)儀購(gòu)于日本Bio-Rad公司,CX41倒置光學(xué)顯微鏡和OLSCKX53倒置熒光顯微鏡均購(gòu)于日本OLYMPUS公司,電子分析天平購(gòu)于上海玉研科學(xué)儀器有限公司,Amersham電泳儀購(gòu)于瑞典Bioscience公司,恒溫水浴搖床和YCZ-40D型轉(zhuǎn)移電泳槽均購(gòu)于北京六一儀器廠,FluorChem FC3凝膠成像數(shù)碼分析系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)ProteinSimple公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1免疫組織化學(xué)法 嚴(yán)格按照SP試劑盒說(shuō)明書的步驟進(jìn)行操作.隨機(jī)選擇10個(gè)視野,觀察GRP78的陽(yáng)性表達(dá)情況.GRP78陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn):以細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色染色判定為GRP78陽(yáng)性表達(dá).①陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):不著色0分,淡黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分;計(jì)算10個(gè)視野下的染色平均分值.②陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比為0,記0分;1%～25%,記1分;26%～50%,記2分;51%～75%,記3分;>75%,記4分.根據(jù)染色指數(shù)判定結(jié)果,染色指數(shù)=陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分X細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分.根據(jù)染色指數(shù)將切片分為陰性(0～1分),弱陽(yáng)性(2～5分),中陽(yáng)性(6～10分),強(qiáng)陽(yáng)性(>10分).弱陽(yáng)性、中陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性均為GRP78細(xì)胞陽(yáng)性.

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將Tca8113細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,將細(xì)胞置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng).24～48 h更換培養(yǎng)液,48 h傳代一次.

1.3.3 耐藥細(xì)胞株的建立 經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LOHP作用于Tca8113細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(half inhibition concentration,IC50)為 19.44 μg/ml,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞Tca8113,加入2 μg/m(l終濃度約為1/10 IC50)的L-OHP作用48 h后進(jìn)行傳代,重復(fù)上述步驟孵育72 h后,棄上清;然后重復(fù)同樣的步驟,將L-OHP的終濃度提高一倍(L-OHP終濃度分別為2、3、4、5、6 μg/ml);直至Tca8113細(xì)胞可在5 μg/ml(終濃度約為1/4 IC50)L-OHP的作用環(huán)境下正常生存,然后以含加倍濃度(12～24 μg/ml)的大劑量LOHP對(duì)Tca8113細(xì)胞進(jìn)行間斷誘導(dǎo),從而成功獲得了生長(zhǎng)良好的耐受24 μg/ml L-OHP的耐藥細(xì)胞株,命名為Tca8113-L-OHP.棄培養(yǎng)上清,采用無(wú)菌PBS沖洗3次后,加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng).

1.3.4 MTT法 采用噻唑藍(lán)(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力.將Tca8113細(xì)胞或者Tca8113-L-OHP耐藥株(1X104/孔)單層接種至96孔板中,置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),加入32 μg/ml的LOHP,檢測(cè)Tca8113細(xì)胞和Tca8113-L-OHP細(xì)胞中JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá).設(shè)置10個(gè)平行孔,24 h后,受試組細(xì)胞加入4、8、16、32、64 μg/m(l終濃度)L-OHP,而空白對(duì)照組細(xì)胞未作任何處理,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,每孔加入20 μl MTT,置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后,棄上清液,每孔加入200 μl DMSO,置于振動(dòng)器上振蕩5 min,置于顯微鏡下觀察無(wú)紫色結(jié)晶物.將96孔板放置于酶標(biāo)儀上,檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm,參比波長(zhǎng)為450 nm處的吸光度(absorbance,A)值,計(jì)算平均值.根據(jù)計(jì)算公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(inhibition rate,IR).IR(%)=(A空白對(duì)照組-A受試組)/A空白對(duì)照組X 100%.

1.3.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 提前1天在相應(yīng)備行轉(zhuǎn)染的6孔板上接種5X105個(gè)Tca8113-L-OHP細(xì)胞,分為2個(gè)實(shí)驗(yàn)組:GRP78 siRNA轉(zhuǎn)染組和陰性對(duì)照組.培養(yǎng)24 h后,當(dāng)融合度達(dá)到50%～60%時(shí),按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作,在EP管中分別加入5 μl預(yù)先配置的GRP78 siRNA以及250 μl的無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基,混勻,室溫放置10 min;另外在5 μl LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體溶液中加入 250 μl無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)液,振蕩混勻后,室溫放置10 min;將上述兩種溶液吹打混勻,室溫放置30 min;將脂質(zhì)體-質(zhì)粒DNA復(fù)合液滴加至孔板細(xì)胞表面,置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h.陰性對(duì)照組的轉(zhuǎn)染方法與上述GRP78 siRNA的轉(zhuǎn)染方法一致,而轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列不同.未轉(zhuǎn)染的Tca8113-L-OHP細(xì)胞僅進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng).提取Tca8113-L-OHP細(xì)胞RNA,驗(yàn)證目的基因的相對(duì)表達(dá)量.

1.3.6 提取總RNA ①收集1X1010個(gè)細(xì)胞,置于EP管中;②加入1 ml預(yù)冷的Trizol,充分混合均勻,靜置5～10 min;③加入200 μl三氯甲烷,振蕩30 s,靜置5～10 min;④12000 r/min離心5 min,離心半徑為8 cm,取上清;⑤加入 500 μl異丙醇,振蕩 30 s,靜置5～10 min;⑥12000 r/min離心5 min,離心半徑為8 cm,棄上清;⑦加入1 ml的75%乙醇,振蕩30 s,12000 r/min離心5 min,離心半徑為8 cm,棄上清;⑧將EP管倒置于濾紙上,將RNA充分干燥;⑨加入20 μl的DEPC水溶解沉淀,分裝,置于-80℃保存?zhèn)溆?采用瓊脂凝膠電泳檢測(cè)RNA相對(duì)分子量;采用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度.

1.3.7 RNA反轉(zhuǎn)錄 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書的步驟進(jìn)行操作.將cDNA置于-20℃的溫度下保存?zhèn)溆?

1.3.8 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chainreaction ,RT-PCR)將20 μl的反應(yīng)體系置于37℃恒溫中水浴60 min,85℃5 s,加入去離子水至 100 μl,各反應(yīng)孔取 2 μl進(jìn)行 PCR.冰浴中配制20 μl PCR反應(yīng)體系,95℃30 s預(yù)變性,95℃5 s,60℃30 s,共進(jìn)行45個(gè)循環(huán).根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的資料設(shè)計(jì)引物序列,引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供.根據(jù)使用說(shuō)明調(diào)整基線,將閾值設(shè)定在熒光值對(duì)數(shù)圖的線性部分,從軟件中讀取Ct值.ΔCt=樣品 Ct均值-內(nèi)參 Ct均值,ΔΔCt=ΔCt-(隨機(jī)陰性對(duì)照樣品Ct均值-內(nèi)參Ct均值),以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量.

1.3.9 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)①提取蛋白樣品;②蛋白樣品凝膠電泳;③轉(zhuǎn)膜;④封閉;⑤加入JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3一抗孵育;⑥加入二抗孵育;⑦顯影;⑧采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)膜上的蛋白表達(dá)條帶,采用FluorChem FC3凝膠成像數(shù)碼分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析,以積分光密度表示灰度值.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)-數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用t檢驗(yàn);多組間比較采用單因素方差分析,多組間兩兩比較采用q檢驗(yàn).計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或率(%)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法.以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 不同組織中GRP78的表達(dá)

口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中GRP78的陽(yáng)性表達(dá)率為84.2%,高于正常口腔黏膜組織的20.0%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).高、中、低分化口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中GRP78的陽(yáng)性表達(dá)率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);高、中、低分化口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中GRP78的陽(yáng)性表達(dá)率均高于正?？谇火つそM織(P<0.05).(表1、圖1)

表1 不同組織中GRP78蛋白的表達(dá)情況

2.2 Tca8113細(xì)胞和Tca8113-L-OHP細(xì)胞對(duì)LOHP的化療敏感性及GRP78的表達(dá)

經(jīng)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,Tca8113細(xì)胞中GRP78 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為(0.29±0.04),明顯低于Tca8113-L-OHP細(xì)胞的(0.83±0.08),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.092,P<0.01).經(jīng)MTT法檢測(cè),經(jīng)不同濃度的L-OHP(4、8、16、32、64 μg/ml)處理后,Tca8113細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制,且隨著LOHP的濃度升高,對(duì)細(xì)胞增殖活性的抑制越明顯,Tca8113細(xì)胞的增殖抑制率明顯高于Tca8113-LOHP細(xì)胞,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表2).

表2 L-OHP對(duì)Tca8113和Tca8113-L-OHP細(xì)胞增殖活性的影響(%,±s)

表2 L-OHP對(duì)Tca8113和Tca8113-L-OHP細(xì)胞增殖活性的影響(%,±s)

縮略語(yǔ):IR=細(xì)胞增殖抑制率

細(xì)胞Tca8113細(xì)胞Tca8113-L-OHP細(xì)胞t值P值IR 4 19.7±2.0 8.9±1.0 14.963 0.000 8 27.5±0.8 12.9±0.9 38.073 0.000 16 44.4±0.6 23.9±0.9 62.679 0.000 32 69.8±1.0 33.4±1.0 80.917 0.000 64 87.0±1.1 43.6±0.8 98.247 0.000

2.3 下調(diào)GRP78對(duì)Tca8113-L-OHP細(xì)胞對(duì)LOHP敏感性的影響

經(jīng)不同濃度的L-OHP作用后,GRP78 siRNA組Tca8113-L-OHP細(xì)胞的增殖活性明顯低于陰性對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).(表3)

表3 轉(zhuǎn)染GRP78 siRNA對(duì)Tca8113-L-OHP細(xì)胞增殖活性的影響(%,±s)

表3 轉(zhuǎn)染GRP78 siRNA對(duì)Tca8113-L-OHP細(xì)胞增殖活性的影響(%,±s)

縮略語(yǔ):IR=細(xì)胞增殖抑制率

Tca8113-L-OHP細(xì)胞陰性對(duì)照組GRP78 siRNA組t值P值IR 4 9.1±0.9 21.4±1.2 25.41 0.000 8 13.2±1.0 32.5±1.0 42.54 0.000 16 23.0±0.8 50.3±0.9 75.27 0.000 32 32.2±1.2 75.4±0.8 99.13 0.000 64 44.9±1.3 91.4±1.1 88.39 0.000

2.4 Tca8113細(xì)胞和Tca8113-L-OHP細(xì)胞中JAK 2/STAT 3信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

加入L-OHP后,Tca8113細(xì)胞中p-JAK2和p-STAT3 mRNA、p-JAK2和p-STAT3蛋白的相對(duì)表達(dá)量均低于Tca8113-L-OHP細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).經(jīng)32 μg/ml的L-OHP作用后,與未加入L-OHP作用的Tca8113細(xì)胞相比,加入L-OHP Tca8113細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3 mRNA和p-JAK2、p-STAT3蛋白的相對(duì)表達(dá)量有所下調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);但是加入L-OHP后,Tca8113細(xì)胞中JAK2、STAT3 mRNA和JAK2、STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量,以及Tca8113-L-OHP細(xì)胞中JAK、p-JAK、STAT3、p-STAT3的相對(duì)表達(dá)量與加入L-OHP前比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).(表4、表5)

表4 Tca8113細(xì)胞中JAK、p-JAK、STAT 3、p-STAT 3的表達(dá)(±s)

表4 Tca8113細(xì)胞中JAK、p-JAK、STAT 3、p-STAT 3的表達(dá)(±s)

加入L-OHP無(wú)有t值P值JAK2 mRNA 1.20±0.13 1.18±0.13 0.344 0.735蛋白0.92±0.12 0.95±0.15 0.494 0.627 p-JAK2 mRNA 0.38±0.07 0.20±0.08 5.355 0.000蛋白0.64±0.15 0.41±0.12 3.786 0.001 STAT3 mRNA 0.91±0.12 0.89±0.13 0.358 0.725蛋白0.64±0.08 0.67±0.10 0.741 0.468 p-STAT3 mRNA 0.45±0.10 0.18±0.04 7.927 0.000蛋白0.58±0.07 0.28±0.05 11.028 0.000

表5 Tca8113-L-OHP細(xì)胞中JAK、p-JAK、STAT 3、p-STAT 3的表達(dá)(±s)

表5 Tca8113-L-OHP細(xì)胞中JAK、p-JAK、STAT 3、p-STAT 3的表達(dá)(±s)

加入L-OHP無(wú)有t值P值1.16±0.18 1.14±0.20 0.235 0.817 0.94±0.14 0.98±0.12 0.686 0.502 0.71±0.11 0.65±0.12 1.166 0.259 1.05±0.17 1.02±0.14 0.431 0.672 0.92±0.10 0.94±0.13 0.386 0.704 0.66±0.09 0.69±0.10 0.705 0.490 0.62±0.06 0.61±0.05 0.405 0.690 0.45±0.07 0.44±0.05 0.368 0.718 JAK2 mRNA 蛋白p-JAK2 mRNA 蛋白STAT3 mRNA 蛋白p-STAT3 mRNA 蛋白

2.5 GRP78對(duì)JAK 2/STAT 3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)RT-PCR和Western blot檢測(cè),轉(zhuǎn)染GRP78 siRNA后,Tca8113-L-OHP細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3 mRNA和p-JAK2、p-STAT3蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于陰性對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).(表6)

表6 Tca8113-L-OHP細(xì)胞中p-JAK、p-STAT 3的表達(dá)

3 討論

目前,臨床上關(guān)于頭頸部惡性腫瘤的治療方法仍以外科手術(shù)切除為主,配合化療和放療輔助治療.如何提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性,盡量提高治療效果,減少不良反應(yīng)的發(fā)生,是目前腫瘤治療領(lǐng)域一直關(guān)注的重點(diǎn)[7].由于腫瘤微環(huán)境發(fā)生較大變化,如缺氧、低糖、酸中毒、炎性反應(yīng)等,從而導(dǎo)致ERS反應(yīng)的發(fā)生[8].因此,一方面激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上相應(yīng)蛋白感受器STAT3、JAK2等將信號(hào)傳遞至細(xì)胞核,啟動(dòng)UPR維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài);另一方面誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳感器GRP78高表達(dá),以提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)對(duì)蛋白的折疊和加工能力[9].GRP78是熱休克蛋白家族成員之一,具有高度保守的結(jié)構(gòu)域,主要參與調(diào)控UPR信號(hào)通路[10].有研究顯示,很多腫瘤細(xì)胞的GRP78呈高表達(dá),并與細(xì)胞耐藥性密切相關(guān)[11].宋佳等[12]發(fā)現(xiàn)特異性下調(diào)GRP78的表達(dá)可增加肝癌細(xì)胞對(duì)厄洛替尼的敏感性.目前,已有研究證實(shí)GRP78在非小細(xì)胞肺癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)[13],但是關(guān)于GRP78在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)及其與化療藥物耐藥性的相關(guān)性尚屬于空白領(lǐng)域,因此,本研究著重探討了GRP78與口腔鱗狀細(xì)胞癌對(duì)L-OHP耐藥性的關(guān)系以及對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路的影響.

L-OHP屬于第三代鉑類藥物,其在口腔鱗狀細(xì)胞癌治療方面的臨床療效已經(jīng)得到臨床的普遍認(rèn)可[14],但是基于筆者多年的臨床經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),很多患者在接受L-OHP治療一段時(shí)間后產(chǎn)生明顯的耐藥性,從而導(dǎo)致患者預(yù)后較差.因此,本研究對(duì)LOHP耐藥性與GRP78的關(guān)系展開(kāi)一系列研究.本研究中,首先證實(shí)了口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中GRP78的陽(yáng)性表達(dá)率高于正?？谇火つそM織(P<0.05),提示口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的ERS表達(dá)升高,為了抵抗惡劣的腫瘤微環(huán)境的影響,GRP78的反饋性表達(dá)上調(diào),避免細(xì)胞發(fā)生程序性死亡或凋亡.隨后本研究通過(guò)藥物濃度遞增間歇誘導(dǎo)法建立L-OPH耐藥細(xì)胞株,經(jīng)RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),Tca8113細(xì)胞中GRP78 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯低于Tca8113-L-OHP細(xì)胞(P<0.01);而且通過(guò)MTT法檢測(cè)結(jié)果也證實(shí),L-OHP對(duì)Tca8113-L-OHP細(xì)胞增殖活性的抑制作用降低,提示Tca8113細(xì)胞對(duì)L-OHP的耐藥性產(chǎn)生可能與GRP78表達(dá)量上調(diào)有關(guān).因此,進(jìn)一步通過(guò)siRNA技術(shù)下調(diào)Tca8113-L-OHP細(xì)胞中GRP78基因的表達(dá),經(jīng)不同濃度的L-OHP作用后,對(duì)Tca8113-L-OHP細(xì)胞增殖活性的抑制作用較陰性對(duì)照組細(xì)胞明顯升高,因此,下調(diào)GRP78后,L-OHP誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的凋亡率明顯上升,由此證明GRP78在口腔鱗狀細(xì)胞癌中具有保護(hù)作用,可作為提高化療敏感性的潛在干預(yù)靶點(diǎn).

JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的重要調(diào)控途徑,大多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展均與JAK、STAT的磷酸化有關(guān),包括口腔鱗狀細(xì)胞癌.既往有研究證實(shí),GRP78可通過(guò)激活STAT3促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和遷移[15].本研究探討了LOHP對(duì)Tca8113和Tca8113耐藥細(xì)胞株中p-JAK2、p-STAT3 mRNA和p-JAK2、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響,結(jié)果顯示L-OHP可以明顯抑制Tca8113細(xì)胞中p-JAK2和p-STAT3的表達(dá),但是對(duì)Tca8113-L-OHP細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)量未見(jiàn)明顯影響,提示JAK/STAT信號(hào)通路可能參與了L-OHP耐藥性的發(fā)生.因此本研究又進(jìn)一步探討了GRP78對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路的影響,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染GRP78 siRNA后,Tca8113-L-OHP細(xì)胞中p-JAK2和p-STAT3的磷酸化水平明顯下調(diào),提示GRP78可通過(guò)調(diào)控p-JAK2和p-STAT3的磷酸化水平而影響細(xì)胞對(duì)LOHP的敏感性.

綜上所述,GRP78在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于正?？谇火つそM織,并且在L-OHP耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)上調(diào),可能與L-OHP的耐藥性有關(guān);下調(diào)GRP78的表達(dá)可降低JAK2和STAT3的磷酸化水平,從而提高口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞對(duì)L-OHP的敏感性,提示GRP78可能是提高口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的潛在靶點(diǎn).但是本研究尚處于實(shí)驗(yàn)階段,距離藥物研發(fā)以及臨床應(yīng)用還需要很長(zhǎng)一段時(shí)間,關(guān)于在藥物作用下GRP78的表達(dá)變化以及確切的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究.