周斌,孫博,呂會娟,艾亮,古雅麗

鄭州市婦幼保健院1產科,2檢驗科,病理科3,鄭州4500000

子宮內膜癌是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一,近些年的發(fā)病率呈上升趨勢,嚴重威脅女性的健康和生命.目前雖然子宮內膜癌的病因及發(fā)病機制尚不明了,但普遍認為是多基因多步驟控制的復雜過程,由于細胞增殖與凋亡比例失衡,導致子宮內膜上皮細胞惡性轉化[1].因此,探索引起子宮內膜癌發(fā)生發(fā)展的分子機制及與腫瘤細胞增殖凋亡有關的特異性蛋白分子,對于該病的診斷及治療具有重要意義.結腸癌轉移相關因子1(metastasis associated in colon cancer 1,MACC1)是肝細胞生長因子/肝細胞生長因子受體(HGF/c-MET)信號轉導通路中的一個關鍵調節(jié)因子[2],在結腸癌的侵襲轉移中有重要作用.隨后有多項研究證實MACC1與胃癌、宮頸癌、膠質瘤的發(fā)生相關[3-5].MACC1對子宮內膜癌細胞增殖凋亡的作用還未清楚.有研究發(fā)現(xiàn)MACC1在子宮內膜癌中表達上調,與其發(fā)生、病理分期、組織分化程度、侵襲等相關[6].鑒于此,本研究通過RNA干擾技術沉默子宮內膜癌中MACC1基因的表達,觀察細胞增殖及凋亡的變化,并進一步研究相關的分子機制.

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑和儀器

人子宮內膜癌細胞株Ishikawa購自ATCC細胞庫,胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Hycloneo公司,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒購自Thermo公司;CCK8試劑盒購自上海生工有限公司,膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙錠(PI)細胞凋亡試劑盒購自華阜康生物科技股份有限公司,MACC1、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3,cleaved caspase 3)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸激酶(phosphorylated serine/threonine kinase,p-AKT)抗體均購自美國abcam公司,酶標儀購自美國Bio Tek公司,流式細胞儀購自美國Bio-Rad公司.

1.2 細胞培養(yǎng)

Ishikawa細胞在含有10%胎牛血清及青鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng),當細胞在培養(yǎng)瓶中的生長融合度約80%時,用0.25%的胰蛋白酶消化傳代.傳2代以上即可用于實驗研究.

1.3 實驗分組及細胞轉染

Ishikawa細胞分為空白對照組(未轉染的細胞)、陰性對照組(轉染合成的陰性對照siRNA)和MACC1轉染組(轉染合成的MACC1-siRNA).取對數(shù)生長期的Ishikawa細胞,以2X105/孔的密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h,細胞達到85%生長融合度時進行轉染,轉染步驟以LipofectamineTM2000說明書為標準.

1.4 CCK 8法檢測細胞增殖

取對數(shù)生長期的各處理組細胞,接種于96孔細胞培養(yǎng)板中,每孔含細胞5X103個,每孔中加200 μl.分別在培養(yǎng)24、48、72 h時終止培養(yǎng).每孔加入CCK8試劑10 μl,37℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h,振蕩5 min后,全自動酶標儀于490 nm波長處檢測各孔細胞的光密度(optical density,OD)值.每組均設置5個復孔,實驗重復3次.

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

依據(jù)Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒說明書進行操作.取對數(shù)生長期的細胞,按照1.3分組進行轉染,轉染48 h后收集細胞,磷酸鹽緩沖液潤洗后制備成1X106/ml的單細胞懸液,流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況.

1.6 Western blot法檢測蛋白表達

收集轉染48 h的各組細胞,經10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離,電轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,5%的脫脂奶粉于室溫下封閉1.5 h,分別加入 MACC1、PCNA、cleaved caspase 3、PI3K、p-AKT、GAPDH(均按照1∶1000稀釋)一抗,4℃孵育過夜后加入二抗,室溫孵育1.5 h,增強型化學發(fā)光法(enhanced chemiluminecence,ECL)進行顯色.以GAPDH作為內參,Quantity軟件分析蛋白條帶的灰度值,計算各蛋白的相對表達量.

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21-.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料以均數(shù)±標準差()表示,多組比較采用單因素方差分析,多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗.以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 轉染效率檢測

MACC1-siRNA轉染Ishikawa細胞48 h后,Western blot法檢測各組細胞中MACC1的蛋白表達,結果顯示,陰性對照組與空白對照組的MACC1蛋白相對表達量比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);MACC1轉染組的MACC1蛋白相對表達量低于空白對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05).(圖1、表1)

2.2 MACC 1-siRNA轉染對Ishikawa細胞增殖的影響

MACC1-siRNA轉染Ishikawa細胞24、48、72 h后,CCK8檢測各組細胞的增殖情況,結果顯示,轉染24 h時3組細胞OD490值比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);轉染48 h和72 h時,MACC1轉染組細胞OD490值均低于空白對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05).(表2)

表1 3組細胞中MACC 1蛋白相對表達量的比較(±s)

表1 3組細胞中MACC 1蛋白相對表達量的比較(±s)

注:*與空白對照組比較,P<0.05

0.577±0.056 0.568±0.051 0.172±0.021*77.919 0.000空白對照組陰性對照組MACC1轉染組F值P值MACC1蛋白相對表達量組別

表2 3組Ishikawa細胞OD490值的比較(±s)

表2 3組Ishikawa細胞OD490值的比較(±s)

注:*與空白對照組比較,P<0.05

OD490值48 h 0.423±0.031 0.417±0.029 0.301±0.026*17.177 0.003 0.215±0.005 0.213±0.005 0.211±0.004 0.545 0.606 0.626±0.045 0.604±0.041 0.418±0.034*24.170 0.001空白對照組陰性對照組MACC1轉染組F值P值24 h 72 h組別

2.3 MACC 1-siRNA轉染對Ishikawa細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測細胞凋亡結果顯示,MACC1轉染組細胞凋亡率高于空白對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05).(圖2、表3)±s)

表3 3組Ishikawa細胞凋亡率的比較(x-

2.4 MACC 1-siRNA轉染對Ishikawa細胞增殖凋亡相關蛋白及PI 3K/AKT信號通路蛋白表達的影響

Western blot法檢測增殖相關蛋白PCNA、凋亡相關蛋白cleaved caspase 3,PI3K/AKT信號通路蛋白PI3K、p-AKT的蛋白表達情況,結果顯示,MACC1轉染組PCNA、PI3K、p-AKT蛋白相對表達量均低于空白對照組,cleaved caspase 3蛋白相對表達量高于空白對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05).(圖3、表4)

表4 3組Ishikawa細胞PCNA、cleavedcaspa se 3、PI 3 K、p-AKT蛋白相對表達量的比較(±s)

表4 3組Ishikawa細胞PCNA、cleavedcaspa se 3、PI 3 K、p-AKT蛋白相對表達量的比較(±s)

注:*與空白對照組比較,P<0.05

組別空白對照組陰性對照組MACC1轉染組F值P值0.665±0.053 0.642±0.051 0.152±0.023*127.243 0.000 0.117±0.015 0.110±0.012 0.263±0.026*64.269 0.000 0.482±0.047 0.465±0.042 0.144±0.018*75.951 0.000 0.106±0.012 0.113±0.013 0.022±0.008*61.218 0.000 PCNA cleaved caspase 3PI3K p-AKT

3 討論

子宮內膜癌病死率居婦科惡性腫瘤第3位,僅次于卵巢癌和宮頸癌,其發(fā)病機制較復雜,目前還未研究清楚,但越來越多的研究顯示子宮內膜癌的發(fā)生發(fā)展是一個與癌基因激活、抑癌基因失活有關的多基因多步驟的復雜過程[7].HGF/c-MET信號通路在多種惡性腫瘤的發(fā)展和進程中發(fā)揮重要作用,參與包括細胞增殖、凋亡、分化等多種生命活動過程[8].MACC1基因已被證實是HGF/c-MET信號通路的關鍵調節(jié)因子,最早是在結腸癌中被發(fā)現(xiàn),可與c-MET啟動子結合,促進腫瘤細胞的增殖、侵襲、血管生長等過程[9].有研究顯示,在肺癌、卵巢癌、膽囊癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)MACC1的存在,與細胞的生長、侵襲、轉移、凋亡等生物學特性及預后密切相關,卵巢癌中抑制MACC1的表達可明顯抑制卵巢癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力,并可誘導細胞的凋亡[10];非小細胞肺癌中抑制MACC1的表達可抑制腫瘤細胞的增殖和促進凋亡[11];膽囊癌中下調MACC1的表達可降低腫瘤細胞的增殖和侵襲能力[12].本研究結果顯示,子宮內膜癌細胞中轉染MACC1-siRNA,細胞的增殖能力降低,凋亡增加.這提示MACC1在子宮內膜癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用.

細胞的增殖失控與凋亡失衡是引起腫瘤發(fā)生的重要原因,受到多種基因的調控.PCNA只在正常增殖細胞及腫瘤細胞內存在,與細胞的DNA合成有密切聯(lián)系,是細胞異常增殖的關鍵蛋白,目前已在子宮內膜癌、胃癌等多種腫瘤中檢測到高表達[13-14].細胞凋亡存在多條通路參與發(fā)生,其中caspase途徑在細胞凋亡過程中有重要作用,caspase 3作為caspase級聯(lián)反應下游最主要的蛋白酶,在細胞凋亡調節(jié)中起主導作用,被稱為"死亡執(zhí)行蛋白酶",其被活化后可使凋亡進入不可逆階段.目前已應用于多種腫瘤凋亡的檢測指標[15-16].PI3K/AKT信號通路是細胞內一個重要的信號轉導通路,參與包括子宮內膜癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17].有研究顯示,子宮內膜癌中PI3K/AKT信號通路處于激活狀態(tài),可促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展,而抑制該信號通路后反之[18].PI3K下游有多種效應分子,AKT是PI3K/AKT信號通路下游直接底物,AKT磷酸化后,可增加腫瘤細胞的運動能力,參與細胞的增殖及凋亡過程,可抑制細胞凋亡而發(fā)揮抗凋亡作用.為了研究RNA干擾MACC1表達后引起細胞增殖凋亡的機制,本研究通過Western blot法檢測PCNA、cleaved caspase 3、PI3K、p-AKT的蛋白表達,發(fā)現(xiàn)抑制MACC1表達后PCNA、PI3K、p-AKT蛋白均下調表達,cleaved caspase 3蛋白上調表達.這提示抑制MACC1表達可通過調節(jié)PCNA、cleaved caspase 3、PI3K、p-AKT蛋白表達影響子宮內膜癌細胞的增殖凋亡.

綜上所述,抑制MACC1基因表達可降低子宮內膜癌細胞增殖,誘導細胞凋亡,上調cleaved caspase 3蛋白表達,下調PCNA及PI3K/AKT信號通路蛋白表達.這提示MACC1可能是臨床上子宮內膜癌分子診斷及靶向治療的靶點.后續(xù)研究中將檢測MACC1在子宮內膜癌中的其他生物學特性,及從體內研究進行深入研究.