鄭賢金，湯 斌

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

纖維素酶作為一種重要的工業(yè)酶制劑，具有環(huán)保、高效地將纖維素轉(zhuǎn)化成人類需要的能源和其他工業(yè)原料的功能，因而被廣泛應(yīng)用于畜牧、紡織、造紙、食品工業(yè)等諸多領(lǐng)域，如作為動(dòng)物飼料添加劑、增加棉織物的光潔度和柔軟度等[1-2]．然而，纖維素酶酶活性低、生產(chǎn)成本高是制約其應(yīng)用的關(guān)鍵因素．為降低纖維素酶生產(chǎn)成本，國(guó)內(nèi)外學(xué)者展開了大量的研究工作，這些研究包括從自然界中篩選高產(chǎn)菌株、在實(shí)驗(yàn)室中對(duì)保藏的微生物菌株進(jìn)行遺傳改良和對(duì)纖維素酶基因進(jìn)行分子改造等．孫尚琛[3]等從牛糞、枯枝、麥垛腐殖質(zhì)中篩選、分離得到一株短小芽胞菌，其FPA酶活最高為1 204 U/mL(等同于6.7 IU/mL)；Zhang X Y[4]等對(duì)里氏木霉Rut-30進(jìn)行甲基磺酸乙酯誘變，獲得突變株D-7，酶活為4.53 IU/mL，比Rut-30提高了57.55%；張飛[5]等利用人工鋅指蛋白文庫(kù)轉(zhuǎn)化里氏木霉Rut-30，篩選高產(chǎn)纖維素酶的突變株，最終FPA酶活達(dá)到4.58 IU/mL．這些手段不同程度提高了纖維素酶的酶活，但距離大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用仍有差距．

研究所使用出發(fā)菌株匍枝根霉TP-02，由安徽工程大學(xué)3R實(shí)驗(yàn)室從國(guó)家5A級(jí)旅游景區(qū)黃山采集分離得到．TP-02具有酶活高、發(fā)酵時(shí)間短等特性[6]，因而可能對(duì)進(jìn)一步提高纖維素酶產(chǎn)量具有重要的工業(yè)應(yīng)用潛力．研究通過對(duì)TP-02誘變處理得到一株高產(chǎn)纖維素酶菌株TZ-03，并對(duì)其培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行10L發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)及發(fā)酵條件控制，最終提高了纖維素酶產(chǎn)量．

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

(1)菌株.匍枝根霉TP-02，為安徽工程大學(xué)3R實(shí)驗(yàn)室篩選及保藏．

(2)主要試劑.甲基磺酸乙酯(Ethylmethylsulfone，EMS)，購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；微晶纖維素，購(gòu)于河南華悅化工產(chǎn)品有限公司；其余試劑均采購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司．

(3)培養(yǎng)基.篩選培養(yǎng)基：CMC 15 g/L，(NH4)2SO42 g/L，MgSO40.5 g/L，KH2PO41 g/L，121 ℃滅菌20 min．種子培養(yǎng)基：10%麩皮浸出汁(100 g新鮮麩皮加入1 000 mL蒸餾水，煮沸30 min，六層紗布過濾并最終定容至1 000 mL)，121 ℃滅菌20 min．發(fā)酵培養(yǎng)基：稻草粉(80目)20 g/L，豆粕粉10 g/L，5%麩皮浸出汁，CaCl22 g/L，MgSO4·7H2O 3 g/L，KH2PO43 g/L，PEG-4000 0.25 g/L，Tween 80 200 μL/L，微量元素溶液1 mL/L，121 ℃滅菌20 min．微量元素溶液：FeSO4·7H2O 0.005 g/L，MnSO4·H2O 0.001 6 g/L，ZnSO4·7H2O 0.001 4 g/L，CoCl2·2H2O 0.002 g/L．

1.2 儀器與設(shè)備

L3 723分光光度計(jì)、SW-CI-10 單面垂直凈化操作臺(tái)、BOXUN立式壓力蒸汽滅菌鍋、SHA-CA數(shù)顯恒溫振蕩器、新亞特正品ZWS 90W紫外燈管、BIOTECH-10JSA-3000PLC自動(dòng)發(fā)酵罐.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

(1)菌株誘變及篩選.將匍枝根霉TP-02接種至PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待其長(zhǎng)成后用無菌生理鹽水從斜面上將孢子洗下并通過計(jì)數(shù)控制質(zhì)量分?jǐn)?shù)在107～108個(gè)/mL，制備孢子懸浮液．取10 mL孢子懸液于9 cm無菌培養(yǎng)皿中，將其置于90 W紫外燈下30 cm處，打開平皿蓋，分別照射1～7 min，間隔1 min，進(jìn)行紫外誘變[7]；取2 mL EMS原液加4 mL pH 7.2的磷酸緩沖液配成EMS母液，處理時(shí)間30～180 s，間隔30 s，進(jìn)行EMS誘變，反應(yīng)結(jié)束后立即加入10% NaS2O3溶液終止反應(yīng)[8]．將處理液梯度稀釋適當(dāng)倍數(shù)后涂布于剛果紅篩選培養(yǎng)基，待其長(zhǎng)成后，以菌落周圍透明圈的大小為主要指標(biāo)，挑取透明圈大、菌落小的菌落轉(zhuǎn)接到PDA斜面上．將初篩得到的菌株接種于種子培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h后按10%接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中．30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)5 d，測(cè)定濾紙酶活，以濾紙酶活為指標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩．以上述誘變后得到的高產(chǎn)菌為出發(fā)菌株進(jìn)行紫外-EMS復(fù)合誘變，其條件為單因子誘變最優(yōu)條件[8]．

(2)發(fā)酵條件優(yōu)化.

①碳氮源優(yōu)化.分別以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的蔗糖、葡萄糖、纖維二糖、木糖、乳糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、糊精、麩皮粉、稻草粉、微晶纖維素、CMC、殼聚糖為碳源，加入到含有豆粕粉1%、麩皮浸出汁2.5%、CaCl20.2%、MgSO4·7H2O 0.4%、KH2PO40.3%、微量元素液0.002%、Tween 80 200 μL/L、PEG-4000 0.025%的250 mL錐形瓶中，裝液量為80 mL．滅菌后按10%接種量接入匍枝根霉種子液，在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)5 d，24 h后每12 h測(cè)定一次濾紙酶活．在確定最佳碳源的條件下，分別以1%的硫酸銨、氯化銨、胰蛋白胨、魚粉蛋白胨、大豆蛋白胨、豆粕粉、豆渣粉、黃豆粉、酵母粉、乳清粉、玉米漿和0.5%的尿素為氮源，按同樣方式發(fā)酵，測(cè)定酶活．

②各種氨基酸的添加對(duì)酶活的影響.以碳氮源單因素實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)結(jié)果為碳氮源，其他成分保持不變，配置發(fā)酵培養(yǎng)基，121 ℃滅菌20 min．向滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加已過濾除菌的各種氨基酸，使其最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%．以10%的接種量接種培養(yǎng)24 h后的TZ-03種子液，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)，每隔12 h測(cè)定濾紙酶活．

(3)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件研究.經(jīng)過培養(yǎng)基組分優(yōu)化確定搖瓶發(fā)酵的最優(yōu)條件，此條件下分別以TP-02和TZ-03為出發(fā)菌株進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶，觀察誘變前后酶活的變化．利用搖瓶?jī)?yōu)化的最佳培養(yǎng)基進(jìn)行10 L發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)．裝液量5 L，接種量為10%，溫度為30 ℃，初始轉(zhuǎn)速300 r/min，初始罐壓0.06 MPa．在發(fā)酵過程中通過對(duì)轉(zhuǎn)速、通氣量和罐壓等參數(shù)的調(diào)節(jié)，控制溶氧維持在30%左右；通過調(diào)節(jié)磷酸、氨水的添加量控制pH維持在4.8左右；發(fā)酵24 h后每隔3 h測(cè)定一次發(fā)酵液中還原糖含量，以還原糖含量為指標(biāo)，調(diào)整20%淀粉水解液的補(bǔ)加速度，控制發(fā)酵液中的還原糖含量基本維持在1.2 mg/mL．

(4)各指標(biāo)實(shí)驗(yàn)方法.

①致死率計(jì)算.分別統(tǒng)計(jì)未經(jīng)紫外和EMS處理的PDA平板菌落數(shù)和經(jīng)過不同時(shí)間誘變處理后的PDA平板菌落數(shù)，按以下公式計(jì)算誘變致死率．

②酶活測(cè)定.取發(fā)酵液1.2 mL于1.5 mL離心管中，3 500 r/min離心10 s后，將上清液用0.05 mol/L pH 4.8檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)用于酶活測(cè)定．分別以1 cm×6 cm濾紙條、1%CMC溶液1 mL、2%微晶纖維素1 mL和1%水楊苷溶液1 mL為底物[9]，測(cè)定FPA酶活、CMC酶活、CBH酶活和BG酶活．酶活定義：適當(dāng)反應(yīng)條件下，每分鐘水解底物生成1 μmol還原糖所需的酶量即為一個(gè)酶活單位，表示為IU/mL．

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株誘變及篩選

(1)單因子誘變.通過致死率計(jì)算得知紫外照射的最優(yōu)時(shí)間為5 min，此時(shí)的致死率為96.15%；EMS的最佳誘變時(shí)間為120 s，菌株的致死率達(dá)到98.63%．以此最優(yōu)條件進(jìn)行多次誘變，將誘變后的孢子懸液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后涂布于剛果紅篩選培養(yǎng)基．利用培養(yǎng)基上透明圈的大小[10]和FPA酶活高低篩選出兩種誘變方式處理后酶活較高的突變株各8株，并命名為UV 01-08，EMS 01-08．

圖1 誘變后各突變株的FPA酶活

誘變后各突變株的FPA酶活如圖1所示.由圖1可知，紫外誘變得到的突變株中UV-05提高明顯，其FPA酶活較TP-02提高了24%；EMS誘變效果優(yōu)于紫外誘變，其中EMS-04的FPA酶活最高，與TP-02相比，其FPA酶活提高了32.2%．誘變劑的復(fù)合處理通常表現(xiàn)為協(xié)同作用，且不同誘變劑處理后的穩(wěn)定性不同，紫外線處理后菌株難以回復(fù)突變[11]．綜合考慮菌株的穩(wěn)定性和酶活選取UV-05、EMS-02、EMS-04、EMS-05、EMS-07為出發(fā)菌株，進(jìn)行后續(xù)復(fù)合誘變．

(2)復(fù)合誘變.對(duì)復(fù)合誘變得到的菌株進(jìn)行初篩、復(fù)篩，最終由UV-05復(fù)合誘變后篩選得到的突變株效果最好，命名為TZ-03，其FPA酶活在108 h可達(dá)到4.96 IU/mL，相對(duì)TP-02提高了37.8%．TP-02與TZ-03的菌落形態(tài)及透明圈對(duì)比圖如圖2所示.由圖2可知，誘變前孢子呈現(xiàn)灰褐色，具有細(xì)長(zhǎng)菌絲；誘變后，菌絲變短，且孢子顏色為黑褐色．通過對(duì)菌落直徑和透明圈直徑之和與菌落直徑比值(H/C)的計(jì)算，TZ-03的H/C值明顯高于TP-02，分別為2.67和1.35．遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示.由圖3可知，10代以內(nèi)TZ-03均能保持較為穩(wěn)定的產(chǎn)酶能力，F(xiàn)PA酶活在5%之內(nèi)波動(dòng)，TZ-03的遺傳穩(wěn)定性良好．

圖2 TP-02與TZ-03的菌落形態(tài)及透明圈對(duì)比圖 圖3 TZ-03的遺傳穩(wěn)定性

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

(1)碳氮源優(yōu)化.碳、氮源在微生物生長(zhǎng)過程中提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及參與部分代謝產(chǎn)物的合成，對(duì)微生物的生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成具有重要作用．碳氮源優(yōu)化對(duì)FPA酶活影響如圖4所示．由圖4a可知，碳源種類對(duì)纖維素酶酶活的影響較為顯著，在以麩皮粉、稻草粉、微晶纖維素、CMC等纖維素類底物為碳源時(shí)，酶活相對(duì)較高．其中2%的微晶纖維素為碳源時(shí)TZ-03在108 h達(dá)到FPA酶活峰值6.72 IU/mL，較對(duì)照組(稻草粉)提高了26.7%．因此，選取微晶纖維素為最佳碳源．在確定最優(yōu)碳源為微晶纖維素的基礎(chǔ)上研究不同氮源對(duì)酶活的影響如圖4b所示.由圖4b可知，當(dāng)以氯化銨、硫酸銨等無機(jī)氮源發(fā)酵時(shí)，F(xiàn)PA酶活只有2 IU/mL左右；當(dāng)選用有機(jī)氮源發(fā)酵時(shí)，酶活明顯高于無機(jī)氮源發(fā)酵．其中，酵母粉、魚粉蛋白胨和胰蛋白胨的效果較好，當(dāng)以魚粉蛋白胨為氮源時(shí)，108 h時(shí)達(dá)到最高酶活8.21 IU/mL，這可能是因?yàn)橛袡C(jī)氮源中含有維生素、生長(zhǎng)因子或微量元素等能夠促進(jìn)菌體生長(zhǎng)或者誘導(dǎo)產(chǎn)酶的物質(zhì)．

圖4 碳氮源優(yōu)化對(duì)FPA酶活影響

(2)氨基酸添加對(duì)酶活的影響.氨基酸類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可透過細(xì)胞膜直接被微生物吸收，會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的合成速度產(chǎn)生相應(yīng)的影響，進(jìn)而影響到這些蛋白質(zhì)所承載的生理活性表現(xiàn)及相關(guān)代謝途徑的調(diào)節(jié)[12]．氨基酸添加對(duì)FPA酶活影響如圖5所示.由圖5可知，在培養(yǎng)基中添加一定量的色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸和谷氨酰胺后，濾紙酶活提高明顯，108 h時(shí)的FPA酶活分別為10.57 IU/mL、10.76 IU/mL、11.09 IU/mL和11.23 IU/mL．酶活的提高可能與纖維素酶的結(jié)構(gòu)有關(guān)，當(dāng)這些氨基酸加入后可能會(huì)對(duì)纖維素酶吸附結(jié)構(gòu)域和谷氨酰胺-脯氨酸激活域等結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，從而可能提高底物表面有效酶的濃度或者纖維素酶激活蛋白的轉(zhuǎn)錄過程[13-14]，最終提高了FPA的酶活．

2.3 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶

通過以上培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基：微晶纖維素20 g/L，魚粉蛋白胨10 g/L，麩皮浸出汁2.5%，CaCl22 g/L，MgSO4·7H2O 4 g/L，KH2PO43 g/L，谷氨酰胺 1 g/L，PEG-4000 0.25 g/L，Tween 80 200 μL/L，微量元素液1 mL/L．

此條件下，TP-02和TZ-03的酶活均在108 h時(shí)達(dá)到最大值，TP-02與TZ-03的酶活比較如圖6所示．由圖6可知，TP-02的纖維素酶酶活中，EG酶活最高，為5.75 IU/mL，CBH酶活最低，為2.32 IU/mL．而突變之后，BG酶活最高，為24.10 IU/mL，CBH酶活最低，為9.7 IU/mL．BG具有將纖維二糖水解成葡萄糖的作用，雖然纖維二糖在纖維素酶的產(chǎn)生過程中有一定的誘導(dǎo)作用，但是過多的纖維二糖也會(huì)抑制EG和CBH的產(chǎn)生[15]．誘變之后，BG酶活增加，可能減弱了纖維二糖對(duì)其他酶的抑制作用，從而使3種酶之間的比例更加合理，總酶活FPA酶活增加．

圖5 氨基酸添加對(duì)FPA酶活影響 圖6 TP-02與TZ-03的酶活比較

2.4 10 L發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)

以搖瓶?jī)?yōu)化最優(yōu)條件進(jìn)行10 L發(fā)酵罐直接放大實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵過程參數(shù)如圖7所示.由圖7可知，0～12 h內(nèi)，糖類物質(zhì)大量被消耗，菌體利用糖類物質(zhì)快速生長(zhǎng)繁殖，此過程可能產(chǎn)生了大量的酸性物質(zhì)使發(fā)酵液中的pH下降，12 h時(shí)，pH已達(dá)最低值3.7．此后可能由于部分酸性物質(zhì)被菌體利用及菌體自溶，pH略有上升，36 h后維持在4.2左右．0～12 h內(nèi)，溶氧量也一直在下降，在10 h時(shí)，溶氧下降到8.7%，并維持將近1 h．之后，溶氧逐漸上升，在66 h以后基本維持在80%左右．10 L發(fā)酵罐發(fā)酵酶活曲線如圖8所示．由圖8可知，F(xiàn)PA酶活在72 h達(dá)到峰值13.80 IU/mL，與搖瓶發(fā)酵的最高酶活11.58 IU/mL相比，上罐發(fā)酵酶活提高并不明顯，這可能是發(fā)酵過程中的溶氧和pH的不合理導(dǎo)致．溶氧的供應(yīng)對(duì)菌體的正常生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)酶均有重要影響，所以一般的生產(chǎn)過程控制溶氧在20%～30%[16]，同時(shí)pH過低不僅不利于菌體生長(zhǎng)，還會(huì)造成一部分纖維素酶酶活損失[17]．因此對(duì)于溶氧和pH的控制可能是上罐發(fā)酵產(chǎn)酶的關(guān)鍵因素，此外，發(fā)酵后期發(fā)酵液中的糖類物質(zhì)過低，只有0.5mg/mL，因此通過適當(dāng)補(bǔ)料提高發(fā)酵液中糖的含量可能是提高酶活的又一手段．

如圖7b可知，研究主要控制轉(zhuǎn)速使溶氧維持在30%左右，同時(shí)通過氨水和磷酸的添加對(duì)發(fā)酵過程的pH進(jìn)行調(diào)控，使其維持在4.8[18]，在發(fā)酵24 h后通過補(bǔ)料使殘?zhí)呛烤S持在1.2 mg/mL左右．其結(jié)果如圖8所示，F(xiàn)PA酶活在84 h達(dá)到峰值21.32 IU/mL，與搖瓶發(fā)酵相比提高了89.8%，時(shí)間縮短了近24 h，與不進(jìn)行調(diào)控的上罐發(fā)酵相比，酶活也提高了54.5%．在此條件下CBH酶活于72 h達(dá)到最大值16.94 IU/mL，BG和EG酶活也在84 h達(dá)到峰值41.06 IU/mL和26.76 IU/mL．

圖7 發(fā)酵過程參數(shù)

圖8 10 L發(fā)酵罐發(fā)酵酶活曲線

3 討論

目前，工業(yè)上的纖維素酶生產(chǎn)菌主要為里氏木霉、綠色木霉、黑曲霉等，而研究中所采用出發(fā)菌株匍枝根霉TP-02為實(shí)驗(yàn)室自主篩選所得，與常用纖維素酶生產(chǎn)菌株相比，具有產(chǎn)量高、發(fā)酵時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)，因此提高其纖維素產(chǎn)量具有重要工業(yè)價(jià)值．當(dāng)前對(duì)匍枝根霉纖維素酶的研究主要集中在分子層面，酶活提高的手段也多為優(yōu)化其培養(yǎng)條件，并未從根本上提高菌株的產(chǎn)酶能力．以匍枝根霉TP-02為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外、EMS和復(fù)合誘變等手段篩選得到一株高產(chǎn)纖維素酶菌株TZ-03，其FPA最高酶活為4.96 IU/mL，較原菌提高37.8%．在此基礎(chǔ)上進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化和10 L發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)，最終使其在以微晶纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基中FPA酶活84 h酶活達(dá)到峰值21.32 IU/mL，菌株產(chǎn)酶能力及產(chǎn)量均得到較大幅度提升．

此外，誘變還改變了纖維素酶酶系組成，TZ-03所產(chǎn)纖維素酶中BG酶活顯著提高．在纖維素酶常見生產(chǎn)菌株中，除黑曲霉外，其他生產(chǎn)菌株如木霉等，其纖維素酶系組成中EG和CBH產(chǎn)量較高，而BG酶活則相比不足，BG具有將纖維二糖分解成葡萄糖從而解除纖維二糖大量積累對(duì)其他酶組分造成抑制的作用，其產(chǎn)量過低會(huì)影響纖維素酶的酶解效率．實(shí)驗(yàn)誘變選育所得TZ-03菌株BG產(chǎn)量較高，后續(xù)研究若能進(jìn)一步對(duì)誘變后BG酶活提高的原因進(jìn)行分析，則會(huì)為其他菌株的酶系組成優(yōu)化提供一定的理論參考，從而為纖維素酶的大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)．