胡洪濤 ，朱志剛 ，李金泉 ，曹春霞 ，邱正明 ，姚經(jīng)武 ，陳偉 ，?；?，王孝琴

（1.湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢，430064；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所；3.武漢市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心）

豇豆根腐病為豇豆苗期重要土傳性病害，在全國豇豆主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，嚴(yán)重時，死亡率高達70%以上。研究認為，武漢地區(qū)的豇豆根腐病的病原為茄腐皮鐮刀菌（Fusarium solaniSchl.）[1]，而四川學(xué)者報道F.commune也可引起豇豆根腐病[2]，但不排除有不同鐮刀菌侵染的可能[3]。一般認為，鐮刀菌從根部或者莖基部侵染，導(dǎo)致表皮腐爛、維管束堵塞，植株萎焉死亡。該菌可長期在土壤中營腐生生活，可隨雨水、農(nóng)事操作等，進行遠距離傳播，而排水不暢、低洼積水的田塊，發(fā)病較為嚴(yán)重。根腐病的防治，生產(chǎn)上主要采用化學(xué)藥劑，如噁霉靈、甲霜靈等，進行灌根，但由于農(nóng)戶育苗時，常常采用田土，導(dǎo)致種苗帶菌，移栽后，再進行藥劑防治效果差，而且化學(xué)藥劑灌根的濃度和用量，都要顯著超過葉面噴霧。因此，研究新型的生物農(nóng)藥，替代化學(xué)藥劑，減少化學(xué)農(nóng)藥用量，是化肥和農(nóng)藥減施的攻關(guān)任務(wù)順利完成的重要保障。

本研究通過生長抑制法，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌（Bacillusspp.）對豇豆根腐菌（Fusariumspp.）具有較好的抑制作用，同時，采用拌種和灌根的方法，能夠有效控制豇豆根腐病的發(fā)生，為研發(fā)控制豇豆根腐病的新型生物農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗田概況

試驗于2016年4～6月，在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所南湖試驗站進行，試驗田為多年豇豆連作田，根腐發(fā)病率高達75%以上。土壤pH值5.35，N、P、K 含量偏低。

1.2 豇豆根腐病菌

豇豆根腐病菌（Fusariumspp.）分離于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所南湖試驗站豇豆根腐病病株，保存于湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心。豇豆根腐病菌采用PA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5～7 d后，采用無菌紗布將孢子過濾出來，調(diào)整孢子懸浮液濃度至1×106個孢子/mL，備用。

1.3 芽孢桿菌制備

芽孢桿菌（Bacillusspp.）為湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心分離和保存。超低溫甘油保存的菌株，首先在LB固體培養(yǎng)基上活化，挑取單菌落在NA液體培養(yǎng)基發(fā)酵24 h，經(jīng)鏡檢無污染后，作為種子在50 L發(fā)酵罐中進行大量發(fā)酵48～72 h，發(fā)酵完成后，調(diào)整菌的濃度至1×108CFU/mL，于4℃保藏，備用。

1.4 芽孢桿菌活性評價

采用對峙培養(yǎng)法，評價芽孢桿菌對豇豆根腐菌的生長抑制活性。方法簡述如下：先將豇豆根腐菌在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3 d后，用無菌的打孔器，將靠近菌落邊緣的菌絲打成菌絲塊，接種于PDA培養(yǎng)基平板中心，并將芽孢桿菌接種于距根腐菌3 cm左右的地方，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d后，檢測結(jié)果。

將芽孢桿菌發(fā)酵液，加入等體積的乙酸乙酯，放置于搖床（150 r/min，30℃）振蕩 1.5 h 后，靜置 1～2 h，酯相采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行旋蒸，殘留物經(jīng)稱重后，用甲醇溶解，按照倍比稀釋法，采用紙碟法進行生物測定，根據(jù)抑菌圈的大小計算抑制中濃度（EC50）。

將PDA培養(yǎng)基固體加熱融化，冷卻至50℃左右，按每250 mL培養(yǎng)基，加入1 mL孢子懸浮液，混勻后，倒入培養(yǎng)皿，待培養(yǎng)基凝固。

取20 μL芽孢桿菌發(fā)酵液提取物，加入消毒后的濾紙碟片，待干燥后，放入含豇豆根腐菌平板，25℃培養(yǎng) 3～5 d，檢查抑菌結(jié)果。

1.5 芽孢桿菌拌種防治豇豆根腐病效果評價

芽孢桿菌發(fā)酵液，分別按照藥種比25 mL∶1 kg、50 mL∶1 kg、100 mL∶1 kg 進行拌種， 對照藥劑為30%噁霉靈水劑（市售），按照藥種比4 mL∶1 kg拌種。加入藥劑，充分?jǐn)嚢杈鶆?、陰干后，播入穴盤。并用清水拌種，作為空白對照（CKT）。 播種后24 h，將根腐菌孢子灌入穴盤，25 mL/穴。穴盤置于25℃人工溫室內(nèi)，12 h光照，12 h黑暗。

1.6 芽孢桿菌灌根防治豇豆根腐病田間試驗

芽孢桿菌采用3個濃度處理，分別稀釋50倍，100倍和200倍，對照藥劑30%噁霉靈水劑稀釋1 000倍，分別在移栽時、移栽后10 d和20 d，按250 mL/株進行灌根。每處理100株，重復(fù)3次，另設(shè)清水對照（CKD）。

1.7 結(jié)果調(diào)查與分析

于豇豆播種7 d后，檢測豇豆發(fā)芽率。播種后30 d，觀察和記錄豇豆發(fā)病情況。大田試驗，在最后一次施藥后20 d，檢查根腐病發(fā)病率、株高和根長等指標(biāo)。數(shù)據(jù)輸入Microsoft Excel進行處理，采用SPSS 19.0進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌發(fā)酵液對豇豆根腐病抑菌效果

平板對峙試驗結(jié)果顯示（圖1），芽孢桿菌對豇豆根腐病菌的生長具有較好的抑制作用，其發(fā)酵產(chǎn)物對豇豆根腐菌的EC50為24.4 mg/L，說明該菌代謝產(chǎn)物中具有較好的抗菌物質(zhì)。

2.2 芽孢桿菌拌種防治豇豆根腐病效果

圖1 芽孢桿菌對豇豆根腐菌的平板抑制效果

表1 不同藥劑拌種處理對豇豆發(fā)芽率和對根腐病的影響

表2 不同藥劑灌根對豇豆根腐病田間防治效果

采用3種不同濃度的芽孢桿菌拌種 （表1），豇豆發(fā)芽率分別為96.5%、96.6%和93.3%，以藥種比50 mL∶1 kg的發(fā)芽率為最高，均顯著高于對照發(fā)芽率（83.2%），其中T1和T2處理的發(fā)芽率略高于對照30%噁霉靈水劑拌種（T4），而T3處理略低于噁霉靈拌種（T4），但在統(tǒng)計學(xué)上均無顯著性差異。

由表 1 可知，T1、T2、T3處理對豇豆根腐病的防效分別為 76.8%、77.8%、89.1%， 其中 T1、T2處理防效顯著性低于30%噁霉靈水劑（P＜0.05），而T3處理與噁霉靈處理無顯著性差異。

2.3 芽孢桿菌灌根防治豇豆根腐病田間試驗效果

由表 2 可知，D1、D2、D3處理豇豆根腐病發(fā)病率分別為19.3%、34.3%、47.3%，顯著低于對照發(fā)病率（P＜0.05），同 30%噁霉靈水劑（D4，14.7%）比較，D1處理防效與其無顯著差異，而D2和D3處理發(fā)病率顯著高于噁霉靈處理。

芽孢桿菌灌根處理（D1、D2、D3）對根腐病的田間防效分別為 74.9%、55.5%、39.1%，D1處理防效（74.9%）與 30%噁霉靈處理（D4，81.4%）無顯著差異（P＜0.05），但 D2和 D3處理顯著低于噁霉靈處理。

3 結(jié)論與討論

豇豆是湖北省乃至全國的主栽蔬菜品種之一，而豇豆根腐病在豇豆主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，由于豇豆生長季為4～6月，正逢長江流域梅雨季節(jié)，豇豆根腐病發(fā)生加重。豇豆根腐病的防治，多采用藥劑灌根處理，然而，由于豇豆根腐菌的初侵染很多時候發(fā)生在苗床，移栽到大田時，即使用藥防治，效果也不理想。因此，篩選有效的種衣劑或者拌種劑，從源頭控制根腐病的發(fā)生，才能更好地防治根腐病。本研究篩選出的芽孢桿菌拌種處理，對豇豆根腐菌生長具有較好的抑制效果，既能較好地促進豇豆種子萌發(fā)，也能預(yù)防根腐病的發(fā)生。同時，田間灌根處理，能較好地防治豇豆根腐病的發(fā)生，其高濃度處理的防效與噁霉靈防效無顯著性差異，但低濃度防效較差。因此，采用芽孢桿菌進行豇豆根腐病防治時，應(yīng)提高使用濃度。