相繼芬，鄧辰辰，劉圓，韓蕾，徐桂紅，蕭偉*

(1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001；2.中藥提取精制新技術(shù)重點(diǎn)研究室，江蘇 連云港 222001)

天麻具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽(yáng)等功能，用于小兒驚風(fēng)、癲癇抽搐等[1]，是中國(guó)的傳統(tǒng)中藥，名貴藥材[2]。中藥配方顆粒為單味中藥經(jīng)現(xiàn)代化提取等過(guò)程制成的新型顆粒劑[3]，是中藥飲片的補(bǔ)充形式，既滿足了中醫(yī)臨床辨證論治、隨證加減的臨床用藥特點(diǎn)[4-5]，又有利于現(xiàn)代智能化藥房的標(biāo)準(zhǔn)化。天麻配方顆粒是天麻飲片經(jīng)水提取、濃縮、干燥、制粒等工序制成的單方顆粒劑。天麻素和天麻苷元即對(duì)羥基苯甲醇為天麻中主要的藥用活性成分[6]，天麻素具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、安眠等作用[7]，對(duì)羥基苯甲醇與天麻素一樣具有鎮(zhèn)痛效果[8]。本文采用高效液相色譜法對(duì)天麻配方顆粒中天麻素和對(duì)羥基苯甲醇的含量進(jìn)行研究，為制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate 3000高效液相色譜儀[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]；Millipore超純水純化系統(tǒng)(美國(guó)密理博公司)；KQ-250DB超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BP211D型電子分析天平(德國(guó)Sartorius)；ME104E電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 試藥

天麻配方顆粒(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：CP161101)；天麻素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110807-201608，純度97.6%)；對(duì)羥基苯甲醇(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111970-201507，純度98.5%)；乙腈為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate LP C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸(4∶96)；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；流速：0.8 mL·min-1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取天麻素對(duì)照品、對(duì)羥基苯甲醇對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相制成每1 mL含天麻素230 μg、對(duì)羥基苯甲醇50 μg的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取天麻配方顆粒適量，研細(xì)，稱取0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密量取乙腈-水(4∶96)50 mL加入，稱定重量，超聲提取30 min，放冷至室溫，再稱定重量，用乙腈-水(4∶96)補(bǔ)足減失的重量，取續(xù)濾液，即得。

3 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1 陰性驗(yàn)證

陰性溶液的制備：天麻配方顆粒在制劑過(guò)程中加入一定量的輔料糊精，為考察輔料是否有干擾，按處方比例稱取適量輔料制成陰性樣品，并按2.3項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液、陰性供試品溶液、供試品溶液各5 μL，注入高效液相色譜儀，見(jiàn)圖1。

注：A.對(duì)照品；B.陰性供試品；C.供試品；1.天麻素；2.對(duì)羥基苯甲醇。圖1 對(duì)照品、陰性供試品、供試品HPLC對(duì)比圖譜

結(jié)果表明，陰性供試品溶液對(duì)天麻素和對(duì)羥基苯甲醇測(cè)定無(wú)干擾。

3.2 線性關(guān)系考察

3.2.1 天麻素 精密稱取天麻素對(duì)照品適量，制得一定濃度的對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為0.986 2 mg·mL-1)。分別取對(duì)照品溶液0.5、1、2、3、5、10 mL分置于6個(gè)容量瓶中，加乙腈-水(4∶96)定容至10 mL，即得質(zhì)量溶度為49.31、98.62、197.24、295.86、493.1、986.2 μg·mL-1的溶液，分別進(jìn)樣5 μL，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X)，天麻素峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，天麻素在49.31～986.2 μg·mL-1呈良好線性關(guān)系，線性回歸方程：Y=205.39X-0.072 5，r=0.999 6。

3.2.2 對(duì)羥基苯甲醇 精密稱取對(duì)羥基苯甲醇對(duì)照品適量，制得一定濃度的對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為0.758 9 mg·mL-1)。分別取對(duì)照品溶液0.1、0.4、0.8、1.2、1.5、2.0 mL分置于6個(gè)容量瓶中，加乙腈-水(4∶96)定容至10 mL，即得質(zhì)量溶度分別為7.589、30.356、60.712、91.068、113.835、151.78 μg·mL-1的溶液，分別進(jìn)樣5 μL，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X)，對(duì)羥基苯甲醇峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，對(duì)羥基苯甲醇在7.589～151.78 μg·mL-1呈良好線性關(guān)系，線性回歸方程：Y=390.42X-0.263 2，r=0.999 6。

3.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取天麻素和對(duì)羥基苯甲醇混合對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算其峰面積，天麻素RSD為0.02%，對(duì)羥基苯甲醇RSD為0.08%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積。天麻素RSD為0.27%，對(duì)羥基苯甲醇RSD為0.38%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批天麻配方顆粒樣品(批號(hào)：CP161101)，按制備供試品溶液方法制備，平行制備6份，測(cè)定其天麻素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為22.506、22.534、22.500、22.500、22.498、22.531 mg·g-1，6個(gè)測(cè)定結(jié)果的RSD為0.07%，對(duì)羥基苯甲醇含量結(jié)果分別為2.655、2.655、2.674、2.651、2.651、2.650 mg·g-1，計(jì)算6個(gè)測(cè)定結(jié)果的RSD為0.34%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.6 加樣回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法[9]，取已知含量的樣品(批號(hào)：CP161101，天麻素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.51 mg·g-1，對(duì)羥基苯甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.65 mg·g-1)約0.25 g，精密稱定，平行稱取6份，置錐形瓶中，各組分別精密加入天麻素對(duì)照品溶液(每1 mL含天麻素10.841 mg)0.5 mL；對(duì)羥基苯甲醇對(duì)照品溶液(每1 mL含對(duì)羥基苯甲醇1.584 mg)0.5 mL，精密加入乙腈-水(4∶96)50 mL，超聲提取30 min，放冷，稱定重量，用乙腈-水(4∶96)補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。分別精密吸取5 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，分別計(jì)算天麻素和對(duì)羥基苯甲醇回收率，結(jié)果見(jiàn)表1，結(jié)果表明該方法回收率良好。

表1 天麻素和對(duì)羥基苯甲醇加樣回收率(n=6)

3.7 樣品含量測(cè)定

取天麻配方顆粒適量，各3份，按照2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定天麻素和對(duì)羥基苯甲醇峰面積，計(jì)算其含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 天麻配方顆粒含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

4 討論

4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

實(shí)驗(yàn)采用DAD檢測(cè)器對(duì)天麻素和對(duì)羥基苯甲醇對(duì)照品混合溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，并對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了選擇。實(shí)驗(yàn)表明，天麻素在220.77 nm處吸收峰響應(yīng)值較高，對(duì)羥基苯甲醇在223.40 nm處吸收峰響應(yīng)值較高，其他色譜峰均不干擾測(cè)定，并通過(guò)參考文獻(xiàn)[10]及《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版，最終確定220 nm作為天麻素和對(duì)羥基苯甲醇共同檢測(cè)波長(zhǎng)。

4.2 流動(dòng)相條件的確定

實(shí)驗(yàn)分別采用不同條件(甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液)為流動(dòng)相進(jìn)行研究考察，結(jié)果表明，以乙腈-0.1%磷酸溶液為系統(tǒng)條件下天麻素和對(duì)羥基苯甲醇均能達(dá)到基線分離，對(duì)稱性良好，故最終確定乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相。

4.3 提取條件的確定

考察不同提取溶劑[50%甲醇、50%乙醇、乙腈-水(4∶96)]、不同的提取方法(回流、超聲)和不同提取時(shí)間(15、30、45 min)等因素對(duì)提取結(jié)果的影響。最終確定提取方案：以乙腈-水(4∶96)為提取溶劑，超聲提取30 min。

4.4 色譜條件耐用性考察

本文通過(guò)對(duì)不同品牌高效液相色譜儀、不同品牌色譜柱、不同流速、不同柱溫進(jìn)行考察，結(jié)果表明本文采用的色譜條件耐用性良好。