李平，張華*，王亞，王燕

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.煙臺(tái)山醫(yī)院，山東 煙臺(tái) 264001)

左金丸原方由黃連、吳茱萸按6∶1組成，有降逆止嘔的作用，專門治療肝火旺盛，橫逆犯胃的病證，是臨床治療肝火犯胃證的經(jīng)典方劑[5]。

方中大量使用性味苦寒、入心經(jīng)的黃連來清心火、瀉怒火，怒火得到清除則肝胃調(diào)和。但氣郁化火之證，只使用黃連既擔(dān)心郁結(jié)化不開，又可能會(huì)折傷陽氣，所以又在其中加入?yún)擒镙牵驗(yàn)閰擒镙蔷哂行翢岬男晕?，它下氣的作用可以幫助黃連調(diào)和胃氣止嘔，辛熱的作用可以來制約黃連的苦寒性味，使此方還可疏肝解郁，肝氣順暢，郁結(jié)能夠化開[6]。

黃連性味苦寒，吳茱萸性味辛熱，它們之間的配伍屬于寒熱配對(duì)，治標(biāo)的同時(shí)又兼顧治本，使其邪氣被去除的同時(shí)，還不傷及體內(nèi)的正氣，藥物組方雖然簡(jiǎn)單，但治病效果顯著，為辛開苦降的代表方劑[7-8]。

延胡索味苦、微辛，溫，擁有通暢血脈、舒暢氣機(jī)又止痛的作用。在原左金丸的基礎(chǔ)上配伍溫中散寒、舒肝理氣之品，可以提高舒肝止痛之效，擴(kuò)大了左金丸的臨床應(yīng)用范圍[9]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

RE-301旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海予華設(shè)備儀器有限公司)；ZTS-1P真空干燥箱(臺(tái)順測(cè)試科技有限公司)；FA2004萬分之一天平(上海良平儀器儀表有限公司)；LC-600B高效液相色譜儀(南京科捷分析儀器有限公司)；GR-202十萬分之一型天平(廣州市艾安得儀器有限公司)；VS-100UE超聲波提取機(jī)(無錫沃信儀器有限公司)；HH.S11-Ni2電熱恒溫水浴鍋(北京三二八科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥

黃連、吳茱萸、延胡索購(gòu)自山東宏濟(jì)堂醫(yī)藥有限公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥教研室李峰教授鑒定均為正品。

鹽酸小檗堿對(duì)照品、吳茱萸堿對(duì)照品、吳茱萸次堿對(duì)照品、延胡索乙素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)依次為110713-201212、110802-200908、110801-201207、110726-201213)；甲醇、濃鹽酸、濃氨水、乙醇等為分析純；乙腈、四氫呋喃、磷酸等為色譜純。

2 不同提取工藝優(yōu)化

2.1 不同提取工藝路線比較

2.1.1 相關(guān)成分含量測(cè)定方法 本實(shí)驗(yàn)為了比較不同工藝有效成分轉(zhuǎn)移率，首先對(duì)黃連、延胡索、和吳茱萸3味有效成分明確的藥根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》方法來檢測(cè)。需要測(cè)定的成分為黃連里的小檗堿、吳茱萸里的吳茱萸次堿與吳茱萸堿、延胡索里的延胡索乙素[10]。

2.1.2 含量測(cè)定結(jié)果 按《中華人民共和國(guó)藥典》測(cè)定方法，對(duì)各藥材的有效成分含量分別測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用藥材中各成分含量測(cè)定結(jié)果 %

2.1.3 不同提取工藝路線篩選

2.1.3.1 水提工藝 取藥材2倍處方量，煎煮3次，使用8倍量的水，每次1.5 h，紗布(8層)過濾，合并濾液，離心，減壓濃縮與干燥，得干膏，分別測(cè)定小檗堿、延胡索乙素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的轉(zhuǎn)移率及得膏率，測(cè)定結(jié)果見表2。

表2水提工藝得膏率及相關(guān)成分轉(zhuǎn)移率測(cè)定結(jié)果

%

結(jié)果分析：由表可知，水提取得膏率較高。從指標(biāo)性成分轉(zhuǎn)移率看，黃連有效成分極性較大，提取率較高，吳茱萸、延胡索有效成分脂溶性較強(qiáng)，提取率較低。通過測(cè)定的數(shù)據(jù)分析證明，醇提的方法可以有效提高藥材中有效成分的轉(zhuǎn)移率和得膏率[14]。

2.1.3.2 乙醇提取工藝考察(單因素考察) 乙醇濃度考察：分別取處方量2倍的藥材，共5份，分別加50%、60%、70%、80%、90%的8倍量乙醇，做3次加熱回流提取，每次1.5 h，過濾時(shí)使用8層紗布，將濾液合并，離心，減壓濃縮與干燥，HPLC測(cè)定樣品中小檗堿、延胡索乙素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見圖1[15]。

轉(zhuǎn)移率(%)=提取完浸膏含量×浸膏量/
含量測(cè)定藥材用量×藥材含量

(1)

圖1 乙醇濃度考察

結(jié)果表明，小檗堿的提取率跟著乙醇濃度的增大，先增長(zhǎng)后消減；而高濃度乙醇有利于延胡索乙素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的提出，可能是由于它們的脂溶性較強(qiáng)。由圖1可知，80%乙醇與90%乙醇對(duì)于有效成分的轉(zhuǎn)移率差別不大，出于經(jīng)濟(jì)考慮，不易選用90%的乙醇。故處方提取溶劑選取80%乙醇[16]。

溶劑用量考察：分別取2倍處方量的藥材，共4份，添加6、8、10、12倍量80%的乙醇，做3次回流提取，每次1.5 h，過濾，使用8層紗布，合并濾液，離心，減壓濃縮與干燥，得干膏，HPLC測(cè)定樣品中小檗堿、延胡索乙素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見圖2[17]。

圖2 溶劑用量考察

結(jié)果表明，溶劑8、10、12倍量對(duì)3種生物堿的提取率影響差異很小，6倍量的溶劑對(duì)3種生物堿的提取率雖較低，但與其他3種水平相比，相差也不太大，出于經(jīng)濟(jì)考慮，故選擇6、8、10倍量這3個(gè)水平來進(jìn)一步考察最佳溶劑用量。

提取時(shí)間考察：分別取處方量2倍的藥材，共4份，各加入8倍量80%的乙醇，進(jìn)行3次加熱回流提取，每次回流時(shí)間分別是1.0、1.5、2.0、2.5 h，過濾，8層紗布，將濾液合并，離心，減壓濃縮與干燥，得干膏，HPLC測(cè)定樣品中小檗堿、延胡索乙素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見圖3。

圖3 提取時(shí)間考察

結(jié)果表明，3種生物堿的提取率隨提取時(shí)間的延伸，先增長(zhǎng)后基本保持穩(wěn)定，故選擇1.0、1.5、2.0 h這3個(gè)水平來進(jìn)一步考察最佳提取時(shí)間[18]。

提取次數(shù)考察：分別取處方量2倍的藥材，共4份，各加入80%的8倍量乙醇，分別加熱回流提取1、2、3、4次，每次1.5 h，8層紗布過濾，合并濾液，離心，減壓濃縮與干燥，得干膏，HPLC測(cè)定樣品中小檗堿、延胡索乙素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見圖4[19]。

圖4 提取次數(shù)考察

結(jié)果表明，提取1次與提取2次3種生物堿的提取率存在很大不同，提取3次與提取4次結(jié)果相近，故選擇1、2、3次這3個(gè)水平來進(jìn)一步考察最佳提取次數(shù)。

醇提工藝參數(shù)的正交優(yōu)選：根據(jù)單因素的考察結(jié)果，取處方量2倍的藥材，以提取時(shí)間、溶劑用量和提取次數(shù)為三要素，每因素?cái)M定三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，測(cè)定小檗堿(a)、延胡索乙素(b)、吳茱萸堿和吳茱萸次堿(c)提取率，計(jì)算出得膏率(d)，優(yōu)選醇提最佳工藝[20]。

綜合評(píng)分為Z，則Z=(ai/amax)×0.5+(bi/bmax)×0.2+(ci/cmax)×0.2+(di/dmax)×0.1(i=1～9)。結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。

表3 復(fù)方醇提工藝因素水平

以上因素對(duì)轉(zhuǎn)移率和浸膏得率的影響依次為：C>A>B，所以C為主要因素，C3>C2>C1；A、B為次要因素，A2>A3>A1，B3>B2>B1，直觀分析最優(yōu)工藝應(yīng)為：A2B3C3。

方差分析：因素C是顯著因素，各水平之間存在明顯區(qū)別，故選擇最優(yōu)水平C3；因素B不是顯著因素，各水平之間無明顯差異，從實(shí)際操作和物力財(cái)力耗費(fèi)考慮，故選擇B2；即初步確定工藝為A2B2C3，所以最終得出了該實(shí)驗(yàn)的最佳方案：加80%的8倍量乙醇，加熱回流提取3次，每次1.5 h。

表4 醇提正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

注：“*”為有顯著性(P<0.05)。

提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)：對(duì)以上實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)工藝A2B2C3與直觀分析得到的最佳工藝A2B3C3進(jìn)行進(jìn)一步的工藝驗(yàn)證，以比較兩種方案的提取效果是否有顯著差異。按處方比例，取2倍處方量藥材2份進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)定各藥物的有效成分提取率，計(jì)算出得膏率，結(jié)果見表6。

表6 提取工藝比較驗(yàn)證結(jié)果(n=3) %

結(jié)果表明，提取率及得膏率差異不是很大，初步擬定工藝可作為本處方的提取工藝。

為考察上述工藝的穩(wěn)定性，取2倍處方量的藥材3份，分別按上述擬定工藝提取，測(cè)定相關(guān)成分提取率，計(jì)算得膏率，結(jié)果見表7。

結(jié)果表明，該工藝穩(wěn)定可行，故認(rèn)為加味左金方的提取工藝為吳茱萸、黃連、延胡索加8倍量，80 %乙醇加熱回流提取3次，每次1.5 h。以優(yōu)選出的最佳工藝進(jìn)行提取，用高效液相進(jìn)行各成分的含量測(cè)定，結(jié)果見圖5～7。

表7 提取工藝驗(yàn)證結(jié)果(n=3) %

注：A.鹽酸小檗堿對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照。圖5 小檗堿含量測(cè)定HPLC圖

注：A.吳茱萸堿對(duì)照品；B.吳茱萸次堿對(duì)照品；C.供試品；D.陰性對(duì)照。圖6 吳茱萸含量測(cè)定HPLC圖

注：A.延胡索乙素對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照。圖7 延胡索乙素含量測(cè)定HPLC圖