劉春秀，王存楊，張斯杰，馬佳，王紹寧*

(1.沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；2.沈陽藥科大學(xué) 制藥工程學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；3.中國中藥有限公司，北京 102600)

中藥砷劑有劇毒，《本草綱目》指出：“砒乃大熱大毒之藥，而砒霜之毒尤烈”。但在“以毒攻毒”的理論指導(dǎo)下砒霜卻成為最早被應(yīng)用于治療惡性腫瘤的傳統(tǒng)藥物[1]。三氧化二砷(As2O3)是砷劑砒霜的主要成分。20世紀(jì)70年代，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院率先用As2O3治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)，取得巨大成功。目前歐洲白血病國際專家委員會(huì)已認(rèn)為As2O3是“APL療法中最具生物學(xué)活性的單體”[2]。由于As2O3具有快速的腎清除率和劑量限制毒性的特點(diǎn)，限制了其在其他腫瘤治療中的應(yīng)用[3-4]。脂質(zhì)體以其獨(dú)特的類細(xì)胞結(jié)構(gòu)和載藥特點(diǎn)成為抗腫瘤藥物的優(yōu)良載體，可改變藥物在體內(nèi)的分布并降低毒性[5]。本課題組采用醋酸銅梯度主動(dòng)載藥法制備了三氧化二砷脂質(zhì)體，建立銀鹽法測定砷的含量及葡聚糖凝膠微柱離心-銀鹽法測定脂質(zhì)體包封率的方法，為制劑評價(jià)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

PHS-25型pH計(jì)(上海精科雷磁)；BS124s電子分析天平(德國賽多利斯公司)；UV-1801型紫外-可見分光光度計(jì)(瑞利分析儀器有限公司，中國)；DF-101S磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠)；UV-260紫外掃描儀(日本Shimadzu)；Anke TDL80-2B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Nicomp-380激光粒度測定儀(美國Particle Sizing Systems公司)；JM-1200EX透射電鏡(日本JEOL)；JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝科器研究所)。

1.2 試藥

氫化大豆磷脂(HSPC，德國Lucas Meyer)；亞砷酸鈉(NaAsO2，成都西亞化工股份有限公司，純度≥96%)；膽固醇(CH，南京新百藥業(yè)有限公司)；聚乙二醇單甲醚2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-DSPE，美國Genzyme公司)；無水乙醇(藥用，安徽安特生物化學(xué)有限公司)；氫氧化鈉(NaOH，天津博迪化工有限公司)；碘化鉀(KI，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司)；氯化亞錫(SnCl2，天津博迪化工有限公司)；無砷鋅粒(天津博迪化工股份有限公司)；醋酸鉛棉花(實(shí)驗(yàn)室自制)；二乙氨基二硫代甲酸銀(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；三乙醇胺(天津博迪化工股份有限公司)；三氯甲烷、濃硫酸(天津市凱信化學(xué))；醋酸銅[Cu(OAc)2·H2O，天津博迪化工股份有限公司]；葡聚糖凝膠G-50(美國Sigma公司)；ZB-1型Na+型陽離子交換纖維(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)

2 方法與結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體的制備

將HSPC、CH及mPEG2000-DSPE按3∶1∶1(w/w/w)的比例混合，加入0.3 mL無水乙醇，于65 ℃水浴中加熱溶解，開蓋攪拌1.5 min以揮除大部分乙醇。加入預(yù)熱至相同溫度的水化介質(zhì)[200 mmol·L-1的Cu(OAc)2溶液]，65 ℃水浴攪拌30 min，得空白脂質(zhì)體初品。以超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理所得脂質(zhì)體(200 W×2 min，400 W×6 min，工作1 s，間歇1 s)后，依次通過0.8、0.45和0.22 μm微孔濾膜各3遍進(jìn)行整粒，得空白脂質(zhì)體混懸液(磷脂質(zhì)量濃度約為50 mg·mL-1)。

取空白脂質(zhì)體混懸液0.1 mL，上樣于經(jīng)離心預(yù)處理的2 mL陽離子交換纖維，同時(shí)加入0.1 mL重蒸水，停留10 min，2000 r·min-1離心4 min，再于柱頂端加入0.05 mL 5%葡萄糖，2000 r·min-1離心4 min洗脫，合并洗脫液，混勻，得最終磷脂濃度約為20 mg·mL-1的具有Cu(OAc)2跨膜離子梯度的脂質(zhì)體混懸液。

取梯度脂質(zhì)體混懸液適量，按藥脂比1∶30(w/w)加入藥物溶液，60 ℃恒溫孵育30 min，冰水浴終止載藥，即得三氧化二砷脂質(zhì)體(含砷量0.3 mg·mL-1)。

2.2 脂質(zhì)體的表征

2.2.1 形態(tài) 取重蒸水稀釋后的三氧化二砷脂質(zhì)體，滴至鍍碳支持膜銅網(wǎng)上，用濾紙從邊緣吸去多余液體。將醋酸雙氧鈾染液滴至支持膜上染色，用濾紙吸去多余的染液，干燥3 h，置于透射電鏡下觀察。見圖1。

圖1 三氧化二砷脂質(zhì)體透射電鏡圖片

由圖1可以看到脂質(zhì)體雙層結(jié)構(gòu)明顯，大小分布均較均勻，未見脂質(zhì)體聚集。

2.2.2 粒徑與Zeta電位 取三氧化二砷脂質(zhì)體適量，用重蒸水行稀釋，使光密度值在250～350，放入樣品池內(nèi)，采用Nicomp-380粒徑/Zeta電位測定儀對粒徑和Zeta電位進(jìn)行測定。測定條件：光源為He-Ne激光(空氣冷卻)；波長λ為632.8 nm；功率為75 mW；溫度為23 ℃。粒徑檢測結(jié)果見圖2。粒徑為110.8 nm，粒徑分布呈高斯分布，PDI值為0.133。脂質(zhì)體Zeta電位為-21.97 mV(見圖3)，呈負(fù)電性，有利于脂質(zhì)體的穩(wěn)定。

圖2 三氧化二砷脂質(zhì)體粒徑分布

圖3 三氧化二砷脂質(zhì)體的Zeta電位測定

2.3 砷含量的測定

2.3.1 溶液的配制 吸收液(二乙胺基二硫代甲酸銀-三乙醇胺三氯甲烷溶液)：稱取0.25 g二乙胺基二硫代甲酸銀[(C2H5)2NCS2Ag，Ag-DDC]粉末，移入100 mL量瓶中，加入1.8 mL三乙醇胺，再用三氯甲烷溶解稀釋至100 mL，放置過夜，濾入棕色瓶中貯存。

硫酸溶液：將濃硫酸與蒸餾水等體積混合后即得。

400 g·L-1氯化亞錫溶液：稱取40 g氯化亞錫溶于40 mL鹽酸中，加蒸餾水稀釋至100 mL，投入數(shù)粒錫粒，此溶液質(zhì)量濃度為400 g·L-1。

砷標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取亞砷酸鈉17.32 mg至100 mL量瓶中，加重蒸水溶解并稀釋至刻度，貯于棕色瓶中，此溶液每毫升相當(dāng)于0.1 mg砷。使用時(shí)吸取此溶液1.0 mL于100 mL量瓶中，加1 mL 10%硫酸，加水至刻度，此溶液每毫升相當(dāng)于1 μg砷。

2.3.2 測定方法 準(zhǔn)確吸取砷標(biāo)準(zhǔn)液適量置于砷化氫發(fā)生器中，加入硫酸溶液10 mL，加蒸餾水至50 mL。加入150 g·L-1的碘化鉀溶液5.0 mL及400 g·L-1的氯化亞錫5滴，混勻，放置15 min。于吸收管中加入5 mL吸收液，插入塞有乙酸鉛棉花的導(dǎo)氣管。依次向各發(fā)生瓶中加入5 g無砷鋅粒，塞緊瓶塞，室溫下反應(yīng)1 h，用三氯甲烷將吸收液體積補(bǔ)充至5.0 mL，以空白吸收液為參比，對反應(yīng)后的吸收液進(jìn)行全波長掃描。見圖4。

圖4 砷與Ag-DDC的復(fù)合物的UV-VIS吸收光譜

由圖4可知，吸收液中砷與Ag-DDC的復(fù)合物在510 nm處有最大吸收波長，因此選擇510 nm為后續(xù)測定的波長。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確吸取砷標(biāo)準(zhǔn)使用液(1 μg·mL-1)4.0、8.0、12.0、16.0、20.0、24.0 mL，分別置于砷化氫發(fā)生器中，加蒸餾水至50 mL，配成標(biāo)準(zhǔn)系列。按2.3.2項(xiàng)下操作，以空白吸收液為參比，510 nm處測定其吸光度，以吸光度值A(chǔ)對砷量(μg)進(jìn)行線性回歸，得線性方程Y=0.023 5X+0.014 3，r=0.999 1，表明砷在4.0～24.0 μg呈線性良好。

2.3.4 精密度 準(zhǔn)確吸取砷標(biāo)準(zhǔn)溶液4.0、16.0、24.0 mL，按2.3.2和2.3.3項(xiàng)下測定吸光度值，連續(xù)進(jìn)樣3次，計(jì)算日內(nèi)日間精密度。結(jié)果為日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)差(%)為1.0、1.48、1.31，日間相對標(biāo)準(zhǔn)差(%)為1.75、1.03、1.22，說明此方法精密度良好。

2.3.5 回收率 取亞砷酸鈉溶液(含砷0.6 mg·mL-1)與空白脂質(zhì)體等體積混合，得砷對照液及砷-空白脂質(zhì)體混合液(含砷0.3 mg·mL-1)。分別取上述混合溶液0.3、0.4、0.5 mL于10 mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。取上述溶液1.0 mL于砷化氫發(fā)生器中，按2.3.2項(xiàng)下方法測定吸光度值，將所得吸光度值由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物濃度，計(jì)算低、中、高3個(gè)濃度的回收率?；厥章?%)分別為98.0、99.4、98.7，RSD(%)分別為2.7、1.5、2.2，表明脂質(zhì)體中的其他成分(脂質(zhì)及銅離子)對測定無影響，回收率良好。

2.3.6 脂質(zhì)體中砷含量的測定 取制備的三氧化二砷脂質(zhì)體0.4 mL，用甲醇溶解并稀釋至10 mL。取上述溶液1.0 mL于砷化氫發(fā)生器中，按2.3.2項(xiàng)下方法測定吸光度值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算藥物含量為0.296 mg·mL-1。

2.4 脂質(zhì)體包封率的測定

2.4.1 葡聚糖凝膠柱的制備 將葡聚糖凝膠Sephadex G-50浸泡在蒸餾水中過夜，充分溶脹。裝于2.5 mL注射器內(nèi)，待水分自然流下，2000 r·min-1離心3 min除水，制備凝膠柱，柱高約為1.0 cm，備用。

2.4.2 葡聚糖凝膠微柱對空白脂質(zhì)體的吸附 采用濁度法考察葡聚糖凝膠微柱對空白脂質(zhì)體的截留情況。取2.1項(xiàng)下空白脂質(zhì)體0.1 mL 4份，分別標(biāo)記為A、B、C和D。A直接轉(zhuǎn)移入5 mL量瓶中。B、C和D均上樣于葡聚糖微柱頂端。B在2000 r·min-1離心3 min后收集洗脫液于5 mL量瓶。C離心后繼續(xù)加0.1 mL 5%葡萄糖溶液于葡聚糖凝膠微柱頂端，2000 r·min-1離心3 min進(jìn)行洗脫，收集經(jīng)離心后的洗脫液于5 mL量瓶。D重復(fù)洗脫2次后，收集經(jīng)離心的洗脫液于5 mL量瓶。將量瓶中A、B、C和D分別用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，并于510 nm處測定吸光度值，記為Atotal、A0、A1、A2。按公式Rn(%)=An/Atotal×100%計(jì)算脫吸附率，結(jié)果見表1。

表1 洗脫次數(shù)對空白脂質(zhì)體的脫吸附率的影響(n=3)

由表1可知，經(jīng)2次洗脫后96%以上的空白脂質(zhì)體被洗脫下來。

2.4.3 葡聚糖凝膠微柱對砷溶液的吸附 分別取砷溶液(0.3 mg·mL-1)0.1 mL各4份，按照2.4.2方法處理，收集于5 mL量瓶中，蒸餾水稀釋到刻度，搖勻，按2.3.2項(xiàng)下操作，在510 nm處，測定其吸光度，記為Atotal、A0、A1和A2，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物量，記為Wtotal、W0、W1和W2，考察洗脫次數(shù)對藥物吸附的影響。脫吸附率根據(jù)公式Rn(%)=Wn/Wtotal×100%。

表2 洗脫次數(shù)對三氧化二砷脫吸附率的影響(n=3)

注：“—”為吸光度值未測出。

結(jié)果表明，藥物在Sephadex G-50凝膠柱上吸附能力較強(qiáng)，經(jīng)2次洗脫后僅有1.46%的藥物被洗脫下來。結(jié)合空白脂質(zhì)體的洗脫結(jié)果(表2)，我們確定分離脂質(zhì)體與游離藥物洗脫次數(shù)為2次。

2.4.4 脂質(zhì)體包封率的測定 取三氧化二砷脂質(zhì)體0.1 mL兩份。一份用甲醇稀釋至5 mL，搖勻。按2.3.2項(xiàng)下操作后，測定吸光度值，計(jì)算總藥量(Wtotal)。第二份上樣于葡聚糖凝膠微柱頂端，2000 r·min-1離心3 min，繼續(xù)加0.1 mL 5%葡萄糖溶液于葡聚糖凝膠柱頂端，2000 r·min-1離心3 min，合并洗脫液用甲醇稀釋至5 mL，搖勻，精密量取1.0 mL于砷化氫發(fā)生器中，按2.3.2項(xiàng)下操作后，測定吸光度值，計(jì)算包封于脂質(zhì)體中的藥物量(記為Wlip)。根據(jù)公式EE(%)=Wlip/Wtot×100%計(jì)算包封率為83.54%。

3 討論

脂質(zhì)體(liposomes)是磷脂等類脂質(zhì)分散于水相中所形成的封閉囊泡，因其具有良好的組織相容性與細(xì)胞親和性而廣泛應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域，具有其他載體無法替代的獨(dú)特優(yōu)勢。脂質(zhì)體是抗腫瘤藥物的理想載體，可以通過高通透性長滯留效應(yīng)(EPR)提高藥物在腫瘤中的滯留，增加癌細(xì)胞對藥物的攝取量，降低給藥劑量，減少藥物對系統(tǒng)和特定部位的毒副作用(如心臟毒性、腎臟毒性)。目前多種抗腫瘤藥物的脂質(zhì)體已上市或進(jìn)入臨床，如鹽酸阿霉素脂質(zhì)體(Doxil?)、阿糖胞苷脂質(zhì)體(DepoCyt?)、紫杉醇脂質(zhì)體(力撲素?)等。三氧化二砷作為中藥砷劑的有效單體，雖然具有抗腫瘤活性，但毒性大、治療窗窄的缺陷限制了其在其他腫瘤治療中的應(yīng)用。本研究利用三氧化二砷具有弱酸性的特點(diǎn)，利用醋酸銅梯度法制備了三氧化二砷脂質(zhì)體，包封率可達(dá)83.54%，以期降低毒性、提高療效，實(shí)現(xiàn)在臨床腫瘤治療中的應(yīng)用。

銀鹽法的檢測原理為，碘化鉀、氯化亞錫將五價(jià)砷還原為三價(jià)砷后經(jīng)歷如下反應(yīng)：

H3AsO3+3Zn+6HCl=AsH3↑+ZnCl2+3H2O

AsH3+6Ag(DDC)=AsAg3·3AgDDC+3HDDC

AsAg3·3AgDDC+3NR3+3HDDC=6Ag+As(DDC)3+3(NR3H)(DDC)

由原理可知，砷化氫產(chǎn)生的速度是影響吸收液吸光度值的關(guān)鍵因素。產(chǎn)生速度過慢(每3 s產(chǎn)生氣泡數(shù)少于1個(gè))或過快(每3 s產(chǎn)生氣泡數(shù)超過9個(gè))都不利于砷化氫的吸收，導(dǎo)致方法重復(fù)性不好，所得精密度不符合規(guī)定。砷化氫的產(chǎn)生速度受鋅粒體積、酸度以及溫度3個(gè)因素的影響。參考文獻(xiàn)[7-9]，我們選擇13～20粒/g的無砷鋅粒，將硫酸用量定為10 mL，溫度控制在27～30 ℃，方法重復(fù)性良好。

測定脂質(zhì)體中的藥物，首先要將其中的藥物釋放出來，即破壞脂質(zhì)雙分子膜。馬滿玲等[9]采用Triton X-100作為破膜劑測定三氧化二砷脂質(zhì)體的包封率，但本研究發(fā)現(xiàn)，向砷化氫發(fā)生器中加入Triton X-100時(shí)，吸收液的吸光度無法測出。這可能是由于Triton X-100是一種表面活性劑，砷化氫發(fā)生器中不斷產(chǎn)生氣泡，就等同于在晃動(dòng)整個(gè)發(fā)生器，所以體系中會(huì)產(chǎn)生大量的泡沫。產(chǎn)生的氣體進(jìn)入氣泡中，使得新生態(tài)氫無法與砷結(jié)合生成砷化氫，同時(shí)生成的砷化氫進(jìn)入氣泡中，不能通過導(dǎo)氣管被吸收液吸收。采用甲醇作為破膜劑，脂質(zhì)體中砷含量的測定不受影響，因此本研究采用甲醇作為破膜劑。

測定包封率時(shí)，脂質(zhì)體與游離藥物的分離方法多種多樣，例如陽離子交換樹脂吸附法[11]、超濾法[12-13]、超速離心法[14]、葡聚糖凝膠柱層析法[15]等。本文采用的葡聚糖凝膠微柱-離心法是對于葡聚糖凝膠柱層析法的改進(jìn)，通過離心加速藥物與脂質(zhì)體分離的過程，同時(shí)減少了對脂質(zhì)體樣品的稀釋。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，一次洗脫后即可分離完全脂質(zhì)體與游離三氧化二砷，簡便快捷。

4 結(jié)論

醋酸銅梯度法適用于制備三氧化二砷脂質(zhì)體，包封率較高。同時(shí)，將銀鹽法與葡聚糖凝膠微柱-離心法相結(jié)合用于三氧化二砷脂質(zhì)體包封率的測定，方法簡單易行，可操作性強(qiáng)。