王征，唐志書，梁艷妮，任浪浪，程靜，宋忠興

(陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心/陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/陜西省風(fēng)濕與腫瘤類中藥制劑工程技術(shù)研究中心，陜西 咸陽 712046)

中藥是一個(gè)復(fù)雜體系，一種中藥中常含有多種結(jié)構(gòu)、性質(zhì)不盡相同的化學(xué)成分，這也是中藥多靶點(diǎn)多效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)[1]。中藥在炮制、煎煮的過程中，各種化學(xué)成分之間發(fā)生著復(fù)雜多變的各類物理、化學(xué)變化，從而使這一原本復(fù)雜的體系更加復(fù)雜。長期以來，學(xué)界往往以中藥的某類或某幾個(gè)化學(xué)成分作為中藥質(zhì)控的標(biāo)準(zhǔn)，而忽視了反映中藥作為一個(gè)整體的物理化學(xué)性質(zhì)的變化[2]。課題組經(jīng)過長期研究發(fā)現(xiàn)，不同炮制方法、不同溶劑提取的中藥，其自身物理化學(xué)性質(zhì)存在很大區(qū)別[3-4]。中藥自身的物理化學(xué)性質(zhì)是中藥中不同化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)組成的外在表現(xiàn)，具有便于檢測、性質(zhì)穩(wěn)定、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，與中藥質(zhì)量及其藥效學(xué)具有密切的聯(lián)系[5]。故此，探索中藥自身的物理化學(xué)參數(shù)與中藥質(zhì)量和藥效學(xué)之間的關(guān)系，建立中藥-物理化學(xué)性質(zhì)-藥效學(xué)研究模式，對(duì)于將中藥作為一個(gè)整體，解決中藥質(zhì)量控制和藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)都具有廣泛的指導(dǎo)意義。

元胡又名延胡索，為罌粟科植物CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥塊莖。具有活血、行氣、止痛的功效，主要用于氣血瘀滯諸痛癥[6]。歷代對(duì)元胡的炮制有生用、炒、醋炙、酒炙、鹽炙等[7]。2015版《中華人民共和國藥典》載有生元胡和醋元胡?，F(xiàn)代植物化學(xué)研究表明，元胡主要活性成分為異喹啉生物堿類，主要有原小檗堿型，原阿托品堿型，阿樸菲型，苯并菲啶型等[8-10]。藥理學(xué)顯示元胡除了具有非常好的鎮(zhèn)痛作用外，對(duì)心血管系統(tǒng)疾病和腫瘤都具有良好的治療作用[11]。目前關(guān)于元胡的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理作用研究較多，但關(guān)于其物理化學(xué)性質(zhì)及其與藥效作用之間的關(guān)系尚未見研究報(bào)道。故，課題組在前期研究的基礎(chǔ)上，研究了元胡醋炙前后水提液物理化學(xué)性質(zhì)的變化，并將其與兩者的抗腫瘤細(xì)胞活性聯(lián)系起來，對(duì)于探索建立中藥-物理化學(xué)性質(zhì)-藥效學(xué)研究模式提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

TGL-20B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)、ZDHW調(diào)溫電熱套(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)、黏度計(jì)(美國BROOKFIELY 博力飛))、VaCo型低溫冷凍干燥儀(Zirbus technology)、PHSJ-4F實(shí)驗(yàn)室PH計(jì)(儀電科學(xué)儀器)、DDS-307電導(dǎo)率儀(上海精科)、激光粒度分析儀(Malvern 3000)、CO2恒溫培養(yǎng)箱(Sanyo公司)、Thermo 熱點(diǎn)Multiskan FC酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)、高溫滅菌鍋、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、TS100-F顯微鏡(Nikon公司)、超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞株HepG2、人肺癌細(xì)胞株A549均購自西安運(yùn)達(dá)生物科技有限公司。

1.3 藥品與試劑

元胡中藥材，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室主任王繼濤高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為罌粟科植物CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥塊莖(陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20170101)；醋元胡中藥材，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室主任王繼濤高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為罌粟科植物CorydalisyanhusuoW.T.Wang的醋制干燥塊莖(陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20170101)；蒸餾水(HyClone改良型RPMI-1640)；培養(yǎng)液(賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司)；胎牛血清(美國Biological Industries 公司，批號(hào)：1552680)；MTT；磷酸緩沖液；0.25%胰蛋白酶(Solarbio公司，批號(hào)：20170315)；無菌水；去離子水；DMSO。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 元胡與醋元胡水煎液的制備

稱取元胡20.0 g，加10倍量的水即200 mL，浸泡30 min，煮沸后保持微沸1 h，濾過，取濾液備用。藥渣加8倍量的水，再煎煮1 h，濾過，取濾液。兩次濾液合并，濃縮并定容至100 mL，5000 r·min-1離心15 min，備用。

醋元胡水煎液的制備同上。

為避免實(shí)驗(yàn)誤差，上述同一批號(hào)的藥材重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)操作，所得藥液分別進(jìn)行以下物理化學(xué)參數(shù)測定。

2.2 物理化學(xué)參數(shù)的測定

取上述制備的元胡和醋元胡水提液，均通過恒溫槽控制在25 ℃，采用馬爾文粒度儀測定水提液的粒徑和Zeta電位，pH 計(jì)精密測定pH，電導(dǎo)率儀測定電導(dǎo)率，旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì)測定黏度。上述每組供試液重復(fù)測定三次。

將上述數(shù)據(jù)測定完成之后，將三次元胡的水煎液和醋元胡的水煎液分開合并，置于水浴鍋上蒸發(fā)至浸膏狀，-80 ℃冷凍24 h，然后置于冷凍干燥器中干燥24 h，取出，研成細(xì)粉，備用。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將HepG2和A549細(xì)胞分別消化于含有10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(pH 7.0～7.4)中，在恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.4 受試藥液的制備

精密稱量元胡及醋元胡凍干粉50 mg，用空白培養(yǎng)液配成10 mg·mL-1母液，0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。將母液分別稀釋4倍，10倍，即2.5 mg·mL-1、1 mg·mL-1，再將1 mg·mL-1稀釋4倍，即0.25 mg·mL-1，置于4 ℃保存，備用。

2.5 MTT試驗(yàn)

分別取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞株，調(diào)整細(xì)胞密度為每升5×107，接種于每孔200 μL RPMI-1640培養(yǎng)基的96孔板上，置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后更換新鮮培養(yǎng)液，每孔200 μL。實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度(10、2.5、1、0.25 mg·mL-1)藥品溶液，每孔終濃度分別為0、10、20、50、100、200、400、800、1200 μg·mL-1；同時(shí)設(shè)置對(duì)照組和調(diào)零孔，每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)平行孔。加藥完畢后96孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，換新鮮培養(yǎng)液(每孔180 μL)，每孔加入新鮮配制的MTT溶液(5 g·L-1)20 μL，繼續(xù)在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，每分鐘60次，震蕩10 min后，用酶聯(lián)免疫標(biāo)定儀測定490 nm 處吸光度(A)值，計(jì)算藥液對(duì)腫瘤細(xì)胞生長增殖的抑制率。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果與討論

3.1 物理化學(xué)參數(shù)測定結(jié)果

對(duì)元胡和醋元胡水煎液各項(xiàng)物理化學(xué)參數(shù)測定結(jié)果如下表1所示。

表1 元胡與醋元胡水煎液物理化學(xué)參數(shù)測定結(jié)果

注：**表示醋元胡水煎液各參數(shù)與元胡水煎液各參數(shù)對(duì)比，P<0.01。

可以看出元胡水煎液的粒度、黏度、電導(dǎo)率小于醋元胡水煎液，而Zeta電位和pH大于醋元胡水煎液。為了更直觀的看到這種變化規(guī)律，將這五種物理化學(xué)參數(shù)變化做成柱形圖，如下圖1：

從圖中可以看出，醋炙后水煎液的粒度、黏度、電導(dǎo)率增加，而Zeta電位和pH都有所下降。其中粒度、黏度和電導(dǎo)率變化顯著，Zeta電位和pH雖有變化，但不具備顯著性。

注：A.元胡與醋元胡水煎液粒度、黏度、電導(dǎo)率、Zeta電位和pH變化圖；B.A圖單位過大，將電導(dǎo)率、Zeta電位和pH單獨(dú)作圖。圖1 元胡與醋元胡水煎液物理化學(xué)參數(shù)

研究表明，生物堿是元胡的主要活性成分。許翔鴻等[12]從元胡中分離得到13個(gè)生物堿單體，其中12個(gè)結(jié)構(gòu)明確，分別是d-紫堇堿、四氫巴馬亭(延胡索乙素，THP)、去氫紫堇堿、巴馬汀、四氫黃連堿、四氫小檗堿、異紫堇球堿、原托品堿、四氫非洲防己胺、Saulatine、海罌粟堿、脫氫海罌粟堿。張曉麗等[13]從元胡中分離得到紫堇明、氧海罌粟堿(oxoglaucine)、降氧化北美黃連次堿、山崳酸、β谷甾醇、胡蘿卜苷、香草酸、對(duì)羥基苯甲酸；Chen等[14]從元胡中分離得到13-甲基-巴馬土賓及13-甲基-去氫紫堇薩明堿。

從上述研究可以看出，元胡中含有大量生物堿，且具有廣泛的藥理作用。另有研究表明，元胡經(jīng)醋炙后其中的生物堿成分溶出明顯增多[15-16]。生物堿為含N的一類次生代謝產(chǎn)物，經(jīng)醋炙后形成醋酸鹽而使其在水中的溶解性增加，從而溶出度增大。2015版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，醋炙時(shí)“加醋拌勻，悶透，置炒制容器內(nèi)，炒至規(guī)定溫度，取出，放涼?！盵17]由此可以看出，醋炙后多余的醋酸基本揮發(fā)干凈，而與元胡生物堿成鹽中和的醋酸已不顯酸性。由上述張曉麗的研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，元胡中還含有香草酸、山崳酸及對(duì)羥基苯甲酸等酸性成分，故水煎液成酸性。醋炙前后pH變化不明顯。

電導(dǎo)率可以反應(yīng)出溶液中離子濃度的多少，醋炙后生物堿成鹽，溶液中離子濃度也同時(shí)增加，故醋炙后水提液的電導(dǎo)率增加。Zeta電位是溶液體系穩(wěn)定性的指標(biāo)。如果顆粒帶有很多負(fù)或正的電荷，即就是Zeta電位很高，其相互排斥，從而使整個(gè)體系趨于穩(wěn)定。相反，如果顆粒帶有很少負(fù)或正電荷，即Zeta電位較低，顆粒之間即會(huì)相互吸引，從而使整個(gè)體系不穩(wěn)定。醋炙后，帶負(fù)電荷的生物堿被醋酸的質(zhì)子中和，水提液中生物堿濃度雖然增加，但其為中性的生物堿醋酸鹽，故負(fù)電荷降低，Zeta電位同時(shí)降低，但不具有顯著性。Zeta電位的降低引起了粒子之間的相互吸引，故整個(gè)體系的粒度增加，黏度同時(shí)也增加，且具有顯著性差異。

3.2 醋炙對(duì)元胡提取液抗腫瘤細(xì)胞活性影響

用MTT法分別檢測元胡和醋元胡水提液凍干粉在0～1200 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)HepG2和A549細(xì)胞體外生長增殖的影響，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理后如下表1所示。

表2 元胡和醋元胡不同濃度提取液對(duì)HepG2和A549細(xì)胞的抑制率

從上表2可以看出，元胡和醋元胡水提液凍干粉在所選濃度范圍內(nèi)都對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞株有一定的抑制作用，且隨著濃度的增大，抑制率也隨之增大。為了更加直觀看出這種變化，以抑制率對(duì)濃度作圖，結(jié)果如下圖2所示：

注：A.元胡和醋元胡不同濃度提取液對(duì)HepG2的抑制作用；B.元胡和醋元胡不同濃度提取液對(duì)A549的抑制作用。圖2 元胡和醋元胡不同濃度提取液對(duì)HepG2和A549細(xì)胞的抑制作用

從上圖可以看出，元胡和醋元胡水提液凍干粉對(duì)HepG2和A549細(xì)胞的生長增殖都有一定的抑制作用，且抑制率隨濃度的增加而增大。在所選濃度范圍內(nèi)，元胡水提液凍干粉對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞生長增殖的抑制作用弱于醋元胡水提液凍干粉。元胡中的主要活性成分為生物堿類，而醋炙的過程會(huì)使元胡中生物堿成分溶出增加，故其活性強(qiáng)于生品，這也是元胡炮制的主要原因。

4 討論

中藥水提液既是數(shù)千年中醫(yī)藥傳統(tǒng)用藥習(xí)性的沿襲，又是中藥制藥工藝過程中最基本的中間產(chǎn)物。從物理化學(xué)角度出發(fā)，中藥水提液可被視為一種由混懸液、乳濁液與真溶液共組而成的十分復(fù)雜的混合分散體系。中藥水提液的宏觀性質(zhì)，可用其各種物理化學(xué)表征參數(shù)描述，而這類物理化學(xué)表征參數(shù)，既來源于中藥水提液中各種物質(zhì)的化學(xué)組成，又是水提液體系中各種物質(zhì)不同表現(xiàn)的綜合反饋[18]。

元胡具有行氣、活血、止痛的功效，臨床常用其醋炙品。現(xiàn)代藥理研究表明，元胡主要活性成分為異喹啉生物堿類，且具有良好的抗腫瘤作用。本文著重研究中藥元胡在醋炙前后水提液物理化學(xué)性質(zhì)的變化及對(duì)其腫瘤細(xì)細(xì)胞活性的影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，醋炙后隨著生物堿溶出的增加，水提液的Zeta電位和pH有所降低，但不顯著，而粒度、黏度和電導(dǎo)率則顯著增加。這些參數(shù)的變化與醋炙過程中生物堿與醋酸反應(yīng)形成醋酸鹽而增溶密切相關(guān)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，醋炙后的元胡水提液凍干粉對(duì)HepG2和A549細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于元胡水提液凍干粉。

中藥水提液的物理化學(xué)性質(zhì)與其所含化學(xué)成分密切相關(guān)，而這些化學(xué)成分又是中藥得以發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[18]。因而，本文將元胡和醋炙元胡水提液的物理化學(xué)性質(zhì)與其抗腫瘤活性進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究，在揭示元胡醋炙對(duì)其水提液物理化學(xué)參數(shù)及抗腫瘤細(xì)胞活性影響的同時(shí)，也是對(duì)建立中藥-物理化學(xué)參數(shù)-藥效學(xué)研究模式的一次探索。而這一切變化都源于醋炙后中藥自身化學(xué)成分的變化。中藥是一個(gè)復(fù)雜的體系，含有多種化學(xué)成分，當(dāng)前尚無任何一味中藥的化學(xué)成分被完全研究清楚。古人將中藥作為一個(gè)整體，提出了其性、味、歸經(jīng)以指導(dǎo)臨床用藥。中藥藥性作為遣方用藥最基本的理論，與中藥的功效密切相關(guān)。在中醫(yī)藥現(xiàn)代化的今天，中藥藥性的研究仍然是中藥學(xué)研究的重點(diǎn)領(lǐng)域。將液體物理化學(xué)參數(shù)的概念引入到中藥水煎液研究當(dāng)中，借助現(xiàn)代科學(xué)可量化的參數(shù)，表征傳統(tǒng)藥液的性質(zhì)。每味中藥所含化學(xué)成分不同，因此其水煎液所具有的物理化學(xué)參數(shù)必然不同。同時(shí)，每味中藥也有著自己獨(dú)特的藥效，而這些藥效往往通過所含化學(xué)成分來發(fā)揮作用。因此，構(gòu)建中藥-物理化學(xué)參數(shù)-藥效學(xué)之間的關(guān)系，從新的視角去審視中藥，借助現(xiàn)代溶液性質(zhì)研究中藥的物理化學(xué)參數(shù)，另避蹊徑，探尋中藥自身的變化規(guī)律，對(duì)解決中藥質(zhì)量控制和藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)都具有重要的指導(dǎo)意義。