姚 珂，韓嘉鈺，賀黎銘，余夢瑤，許曉燕，江 南，李 芳，羅 霞

（四川省中醫(yī)藥科學(xué)院菌類藥材研究所，四川 成都 610041）

靈芝[Ganoderma lucidum(Curbs:Fr.)P.Karst][1]作為我國被人熟知的傳統(tǒng)名貴中藥材，在多種疾病治療與預(yù)防中[2-3]，靈芝的提取物如靈芝多糖、三萜類化合物都起到不可或缺的作用[4]。目前由于科技的發(fā)展，靈芝人工栽培技術(shù)日益成熟，可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模種植。但由于種植的條件[5]、方式不同，靈芝往往只從其農(nóng)藝性狀來判定品質(zhì)好壞，卻忽略所得子實(shí)體中生理活性成分的含量。因此研究了如何通過控制靈芝生長時(shí)空氣CO2濃度[6-9]來提高子實(shí)體三萜含量及其相關(guān)分子機(jī)制，試驗(yàn)結(jié)果不僅有利于靈芝栽培過程條件控制，還有利于提升靈芝藥材的品質(zhì)，最終可以為市場輸出優(yōu)質(zhì)的菌類藥材原料。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

靈芝ZL13（Ganoderma lucidum），由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院菌類藥材研究所提供。

1.2 試驗(yàn)材料和試劑

木屑、棉籽殼、玉米芯、麥麩、石灰和石膏購自農(nóng)資市場；葡萄糖、蒽酮、濃硫酸、香草醛、齊墩果酸、無水乙醇、NaHCO3、冰醋酸、EASYspin Plus RNA快速提取試劑盒、FastQuant RT Kit（with gDNase）、快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA）、Ultra SYBR Mixture（with ROX）、Super Gelgreen染料 （10 000×水溶液）、瓊脂糖；50×TAE電泳液；基因sqs、gdp、ls、hmgr的擴(kuò)增引物。

1.3 供試培養(yǎng)基

母種培養(yǎng)基：馬鈴薯浸出粉3 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

栽培種培養(yǎng)基：麥粒99%、石膏1%，pH自然，含水量為60%。

栽培培養(yǎng)基：木屑15%、棉籽殼60%、玉米芯15%、麥麩8%、石灰1%、石膏1%，pH 5～6，含水量60%左右。將木屑、麥麩、棉籽殼、石灰和石膏混合均勻，摻入預(yù)濕24 h的玉米芯、棉籽殼中拌勻，最后將混合均勻的栽培料堆料發(fā)酵3 d。選用17 cm×33 cm×0.05 cm的聚丙烯袋，每袋裝濕料1 kg，121℃高壓滅菌3 h，冷卻至室溫后每袋接入小麥粒原種10 g左右。

1.4 培養(yǎng)條件和栽培方法

菌絲生長階段的培養(yǎng)溫度為27℃，避光，濕度60%；出芝階段培養(yǎng)條件為光照1 000 lx，濕度85%～90%，日間溫度25℃，夜間溫度22℃。

菌絲滿袋后，打開封口膜，將每個(gè)菌袋口接種部分的基質(zhì)除去，按照下列條件設(shè)置進(jìn)行出芝試驗(yàn)：溫度27℃，相對濕度80%，光照1 000 lx～1 200 lx。

設(shè)置低、中、高三個(gè)濃度組，通過調(diào)節(jié)通氣量，以保證環(huán)境中CO2濃度維持在穩(wěn)定范圍內(nèi)。處理1（CO2低濃度組）：全天不間斷排氣，環(huán)境CO2濃度在0.05%～0.06%（500 mg·L-1～600 mg·L-1）；處理2（CO2中濃度組）：全天每小時(shí)排氣10 min，環(huán)境CO2濃度在0.08%～0.09%（800 mg·L-1～900 mg·L-1）；處理3（CO2高濃度組）：完全封閉，全天不排氣，環(huán)境 CO2濃度在 0.13%～0.14% （1 300 mg·L-1～1 400 mg·L-1）。靈芝生長試驗(yàn)均在人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)完成。

1.5 采樣方法

子實(shí)體取樣方法：根據(jù)靈芝子實(shí)體生長特性，將靈芝生殖生長期分為4個(gè)階段：原基形成期（菌絲扭結(jié)呈白色圓狀或橢圓狀）、菌蕾期（白色子實(shí)體原基開始分化突起，子實(shí)體后端表面出現(xiàn)褐色）、開片期（靈芝子實(shí)體前段開始橫向生長呈扇形，有淡黃色和白色邊緣）、成熟期（靈芝子實(shí)體淡黃色邊緣消失，完成孢子彈射），每個(gè)時(shí)期取3個(gè)重復(fù)樣品，采樣后將樣品按照《中國藥典》（2015年版）的要求，烘干并打碎成粉末，過20目篩后，放置于自封袋內(nèi)，備用待測。

1.6 靈芝三萜的測定方法

靈芝子實(shí)體中總?cè)祁惢衔锖康臏y定，參照《中國藥典》（2015年版）中靈芝三萜的測定方法[10]。

1.7 總RNA的提取

操作前，將要使用的去RNA酶的移液器槍頭和離心管放于高壓蒸汽滅菌鍋中，在121℃高壓蒸汽滅菌20 min。其余試驗(yàn)器械在高溫烘箱中180℃溫度烘干6 h。

總RNA的提取依照EASYspin Plus RNA快速提取試劑盒說明進(jìn)行。

1.8 RNA質(zhì)量檢查

上述所提取的RNA樣品濃度和質(zhì)量，通過核酸蛋白測定儀器（SmartSpec Plus） 和濃度為1.5%的瓊脂糖電泳驗(yàn)證。

RNA質(zhì)量的檢測和定量分析：取RNA樣品10 μL，稀釋10倍，在核酸檢測的儀器紫外光下，檢測RNA樣品的A260/A280數(shù)字并讀取RNA濃度。

RNA完整性的檢測：每20毫升的新鮮的1×TAE液體中，添加0.3 g固體瓊脂糖凝膠，加熱溶解使其完全混合均勻，按每20毫升瓊脂糖凝膠加入1 μL的比例添加Super Gelgreen染料，傾盡模具中，常溫中凝固，拔出制孔梳。清洗電泳槽并向其中倒入新鮮TAE緩沖液，放入制備好的瓊脂糖凝膠，各取 RNA 樣品 5 μL，加入 1 μL 6× loading buffer，點(diǎn)樣，電泳（80 V，20 min）。凝膠成像儀觀察（Gel Doc XR），拍照記錄。符合下游要求的RNA樣品，即為提取成功。

1.9 逆轉(zhuǎn)錄

將上步已經(jīng)成功提取的總RNA，通過購買的快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA） 反轉(zhuǎn)錄為第一鏈DNA（cDNA）（引物是 Oligo d（T） primer），逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于接下來的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）。取2 μg總RNA為模板，構(gòu)建20 μL反應(yīng)體系，具體操作流程參照快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行。

1.10 定量PCR

采用Primer5并參考相關(guān)文獻(xiàn)綜合而得到基因gpd、hmgr、sqs、ls的擴(kuò)增引物[11-12]。以cDNA為模板，進(jìn)行常規(guī)PCR分析。即分別點(diǎn)5 μL擴(kuò)增樣本加入到1.5%瓊脂糖凝膠里，電泳（80 V、20 min）。凝膠成像儀觀察，拍照記錄。

按照Ultra SYBR Mixture（withROX） 試劑盒提供的方法，把cDNA模板逐步按梯度稀釋，優(yōu)化反應(yīng)體系，使用iCycler iQTM實(shí)時(shí)熒光PCR檢測系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量PCR分析。50 μL反應(yīng)體系的成分為：2×擴(kuò)增緩沖液 25 μL、正向引物 （10 μm） 1 μL、反向引物 （10 μm） 1 μL、模板 DNA 2 μL，加雙蒸水至 50 μL。

每個(gè)反應(yīng)體系重復(fù)3次。

采用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序?yàn)?5℃預(yù)變性10 min；95℃變性 15 s，62℃退火/延伸 1 min，40 個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析：95℃反應(yīng)1 min，55℃反應(yīng)1 min，55℃反應(yīng)15 s。在退火/延伸步驟，62℃時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光系統(tǒng)采集。

基因gpd是靈芝生長過程中必需表達(dá)的管家基因，在靈芝體內(nèi)表達(dá)相對穩(wěn)定，故選擇基因gpd為內(nèi)參基因，其余所測目標(biāo)基因均通過基因gpd校正。靈芝子實(shí)體時(shí)間變化規(guī)律試驗(yàn)中，以低CO2濃度組靈芝子實(shí)體和原基期子實(shí)體所測基因表達(dá)量定義為1，其余處理各個(gè)基因的表達(dá)量表征為相應(yīng)倍數(shù)，根據(jù) 2-ΔΔCt法[13]計(jì)算。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 空氣中CO2濃度對靈芝子實(shí)體形態(tài)、總?cè)坪孔兓?guī)律的影響

2.1.1 空氣中CO2不同濃度對靈芝子實(shí)體形態(tài)變化的影響

空氣中CO2不同濃度處理組，靈芝整個(gè)生殖生長時(shí)期不同階段子實(shí)體形態(tài)的變化情況見圖1。

圖1 不同CO2濃度處理組靈芝子實(shí)體生長形態(tài)Fig.1 Growth morphology of Ganoderma lucidum fruiting body in different concentrations of CO2

從圖1可以看出，空氣中的CO2濃度對靈芝子實(shí)體形態(tài)影響顯著。在靈芝原基生長期，CO2低濃度組子實(shí)體原基形態(tài)較為膨大且覆蓋整個(gè)、單一且覆蓋整個(gè)菌袋口生長，并有少許分化跡象；CO2中濃度組和CO2高濃度組子實(shí)體原基叢生且較小，CO2濃度越高，原基形態(tài)發(fā)育越細(xì)長。從整個(gè)靈芝生殖生長階段來看，CO2低濃度組子實(shí)體具有明顯的菌蓋和不明顯的菌柄，而CO2中濃度組具有明顯的菌柄，與CO2低濃度組相比靈芝子實(shí)體菌蓋形態(tài)差異不大；CO2高濃度組，即空氣CO2濃度大于0.1%處理組靈芝子實(shí)體不形成菌蓋，子實(shí)體只伸長生長，最終形成細(xì)長的鹿角狀靈芝。有研究表明空氣CO2濃度[14-15]主要影響靈芝子實(shí)體菌蕾發(fā)育和菌蓋開片的情況。

2.1.2 空氣中CO2濃度對子實(shí)體不同生長期內(nèi)總?cè)坪孔兓?guī)律的影響

空氣中CO2濃度對靈芝子實(shí)體總?cè)坪孔兓?guī)律的影響結(jié)果見圖2。

圖2 不同CO2濃度組靈芝子實(shí)體不同生長期內(nèi)總?cè)坪孔兓疐ig.2 Changes of total triterpene in the different growth stage of Ganoderma lucidum in different concentrations of CO2.

由圖2可以看出，CO2低濃度組靈芝子實(shí)體總?cè)坪侩S靈芝子實(shí)體生長發(fā)育出現(xiàn)先升高，到靈芝子實(shí)體成熟后略有下降；CO2中濃度組靈芝子實(shí)體總?cè)坪砍室恢鄙仙内厔?；CO2高濃度組靈芝總?cè)坪恳恢本S持在一定范圍內(nèi)保持不變。在子實(shí)體發(fā)育的各個(gè)時(shí)期，隨空氣中CO2濃度的升高，靈芝子實(shí)體總?cè)坪恳渤噬呲厔荩渲性谧訉?shí)體發(fā)育早期差異更明顯。有研究表明，空氣中CO2濃度不僅影響靈芝子實(shí)體總?cè)坪?，而且對不同生長期靈芝總?cè)坪康淖兓?guī)律也有明顯影響[14-17]。

圖3 CO2濃度對不同生長期靈芝子實(shí)體中hmgr、sqs、ls基因表達(dá)的影響Fig.3 Effect of different concentrations of CO2on the relative expression of gene hmgr,sqs,ls of Ganoderma lucidum in different growth stage

2.2 CO2濃度對子實(shí)體總?cè)扑岷铣申P(guān)鍵酶基因表達(dá)量的影響

2.2.1 溶解曲線和擴(kuò)增效率的分析

內(nèi)參基因gpd和3個(gè)目的基因hmgr、sqs、ls的熒光定量PCR溶解曲線均為單峰，這表明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較好。

對內(nèi)參基因和3個(gè)目的基因的擴(kuò)增效率進(jìn)行分析，擴(kuò)增效率接近100%，且相對偏差小于5%，可以認(rèn)為4個(gè)基因的擴(kuò)增效率一致，因此，對不同CO2濃度處理組靈芝子實(shí)體三萜酸合成3個(gè)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)分析可采用2-ΔΔCt法。

2.2.2 CO2濃度對子實(shí)體總?cè)坪铣申P(guān)鍵酶基因表達(dá)量的影響

CO2濃度對不同時(shí)期靈芝子實(shí)體中總?cè)坪铣赏緩疥P(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響如圖3所示。

由圖3可以看出，在靈芝子實(shí)體生長的原基形成期和菌蕾期，CO2濃度的升高促進(jìn)了基因hmgr表達(dá)量的增加，而在靈芝子實(shí)體成熟期CO2濃度的升高使基因hmgr的表達(dá)量減少。在原基形成期，CO2中、高濃度組中sqs基因的表達(dá)量不及CO2低濃度組，而從菌蕾期開始，CO2中、高濃度組中sqs基因的表達(dá)量明顯地高于CO2低濃度組，特別是成熟期CO2高濃度組，sqs基因表達(dá)量高于其余2組10倍以上。在靈芝子實(shí)體生殖生長的各個(gè)時(shí)期，ls基因的表達(dá)量均隨CO2濃度的升高呈階梯升高的趨勢。結(jié)合靈芝總?cè)频暮縼砜?，ls基因的表達(dá)量與總?cè)坪孔兓厔菀恢隆?/p>

2.2.3 不同CO2濃度組各生長期各基因表達(dá)量的變化規(guī)律

將不同CO2濃度組原基形成期所測基因的表達(dá)量定義為1，研究不同CO2濃度組在各生長期基因表達(dá)量的變化規(guī)律，結(jié)果見圖4～圖6。

圖4 各生長期不同CO2濃度組基因hmgr表達(dá)量變化Fig.4 Change of relative expression of gene hmgr of each growth stages in different concentrations of CO2

圖5 各生長期不同CO2濃度組基因sqs表達(dá)量變化Fig.5 Change of relative expression of gene sqs of each growth stages in different concentrations of CO2

圖6 各生長期不同CO2濃度組基因ls表達(dá)量變化Fig.6 Change of relative expression of gene ls of each growth stages in different concentrations of CO2

從圖4～圖6可以看出，隨著靈芝子實(shí)體的生長，hmgr基因的表達(dá)量逐漸增加，在開片期表達(dá)量會(huì)有所下調(diào)，但成熟期hmgr基因的表達(dá)量又會(huì)明顯上調(diào)。這說明CO2濃度未影響hmgr基因表達(dá)量的變化規(guī)律。對于sqs基因來說，在菌蕾期和開片期CO2中、高濃度組中其表達(dá)量明顯增加，在成熟期又有所下調(diào)；而CO2低濃度組sqs基因表達(dá)在子實(shí)體發(fā)育后期較原基形成期相對偏低。3個(gè)濃度組中，ls基因的表達(dá)量只在CO2低濃組中菌蕾期有小幅下調(diào)，其余均隨靈芝子實(shí)體生長而增加。結(jié)合總?cè)频淖兓?guī)律來看，ls基因相對表達(dá)量的變化幅度與三萜含量的變化規(guī)律一致。

3 討論

從形態(tài)學(xué)上觀察可知，原基形成期低濃度CO2更適宜靈芝原基的生長，菌蕾期適當(dāng)?shù)厣逤O2濃度有利于靈芝菌柄的形成，但在開片期靈芝則無法承受較高的CO2濃度，當(dāng)CO2濃度高于0.1%時(shí)靈芝將不能形成菌蓋。這表明，靈芝子實(shí)體在不同生長階段對CO2濃度的承受力不同，其中子實(shí)體形成期＞原基形成期＞菌絲生長期。但CO2濃度調(diào)控靈芝子實(shí)體菌蓋形成的具體作用機(jī)制尚不明確，猜測可能與一些子實(shí)體內(nèi)部激素的調(diào)控有關(guān)[18]。

空氣中的CO2濃度對靈芝子實(shí)體三萜含量的變化有顯著的影響。當(dāng)CO2濃度高于0.1%時(shí)，子實(shí)體中三萜含量較高；在靈芝子實(shí)體發(fā)育的早期（原基形成期和菌蕾期），CO2濃度也對靈芝三萜含量影響較大；而成熟期時(shí)由于靈芝自身三萜的合成，CO2濃度對其含量的影響反而較小。

在子實(shí)體發(fā)育的原基形成期和菌蕾期，高CO2濃度組靈芝子實(shí)體生物合成基因hmgr和基因ls的表達(dá)水平與子實(shí)體三萜含量呈正相關(guān)關(guān)系；在子實(shí)體開片期和成熟期，高CO2濃度組基因sqs和基因ls的表達(dá)水平與靈芝子實(shí)體三萜含量呈正相關(guān)關(guān)系。高CO2濃度影響靈芝子實(shí)體三萜含量的升高，這可能是通過調(diào)控靈芝三萜合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。靈芝整個(gè)生殖生長周期中，CO2高濃度和中濃度組中，基因hmgr、sqs、ls的表達(dá)量在其他時(shí)期均高于原基形成期，而CO2低濃度組中菌蕾期和開片期基因sqs的表達(dá)量卻較低，這可能是導(dǎo)致CO2低濃度組中靈芝三萜含量不高的原因。不同CO2濃度組基因ls表達(dá)量在不同生長期的變化規(guī)律與子實(shí)體總?cè)坪康淖兓?guī)律高度一致。在已知的MVP合成途徑中，羊毛甾醇合酶（LS）是合成靈芝三萜中羊毛甾醇的關(guān)鍵，因此推斷基因ls的表達(dá)可能與靈芝三萜的合成多少相關(guān)。CO2濃度可能主要通過誘導(dǎo)基因ls的高表達(dá)以提高靈芝三萜含量。在靈芝子實(shí)體原基形成期，CO2濃度可能同時(shí)誘導(dǎo)了基因hmgr和基因ls的表達(dá)上調(diào)，因此造成三萜含量的差異較大。