曾志恒，曾 輝，2，程 翊，楊 雷，施肖堃，戴建清**

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所，特色食用菌繁育與栽培國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 福州 350014；2.吉林農(nóng)業(yè)大學食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130018）

近年來，食用菌工廠化生產(chǎn)發(fā)展迅速，液體菌種被廣泛地應(yīng)用于工廠化生產(chǎn)金針菇（Flammulina velutiper）、杏鮑菇（Pleurotus eryngit）等食用菌[1-2]。液體菌種具有培養(yǎng)時間短、發(fā)菌快、菌齡整齊一致、接種方便等優(yōu)點，有利于食用菌規(guī)?；⒐S化生產(chǎn)。國內(nèi)外食用菌研發(fā)機構(gòu)和生產(chǎn)企業(yè)加大了對液體菌種的投入和研發(fā)力度[3]。2013年，曾志恒等[4]對雙孢蘑菇液體菌種進行研究，將液體菌種作為原種擴繁生產(chǎn)栽培種取得良好的效果。液體培養(yǎng)基中的碳源是供給菌絲體代謝活動能量的營養(yǎng)物質(zhì)，用作代謝活動能量的碳源物質(zhì)主要為糖類，其中以蔗糖和葡萄糖為主[5]。菌絲體的生長與糖代謝有密切關(guān)系。因此，通過測定發(fā)酵過程中培養(yǎng)液的還原糖和總糖含量變化，可了解菌絲體的生長情況。據(jù)文獻[6]報道，有關(guān)總糖和還原糖含量的測定方法有多種，分為分光光度法、氣相色譜法、液相色譜法、旋光法等。其中，3，5-二硝基水楊酸（DNS） 比色法因具有準確性高、重現(xiàn)性好等特點被廣泛采用。在雙孢蘑菇發(fā)酵液糖含量的測定中，未見使用DNS法測定還原糖和總糖含量的報道。本研究采用DNS法測定雙孢蘑菇發(fā)酵培養(yǎng)液還原糖和總糖含量，確保了試驗的精確度，以期獲得可靠的數(shù)據(jù)，為雙孢蘑菇液體菌種的生產(chǎn)實踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株為雙孢蘑菇 （Agaricus bisporus）As2796。

1.1.2 液體培養(yǎng)基配方

液體培養(yǎng)基配方參考文獻[7]。

1.1.3 主要儀器

UV-1300紫外分光光度計，上海美析儀器有限公司；SH420石墨消解儀，濟南海能儀器股份有限公司；HH-4恒溫水浴鍋，常州凱航儀器有限公司。

1.1.4 試劑

無水葡萄糖、濃鹽酸、氫氧化鈉等，分析純，購自西隴化工股份有限公司。

葡萄糖標準液1.0 mg·mL-1，配制方法參照參考文獻[8]。

DNS試劑，配制方法參照參考文獻[9]中DNS試劑1。

1%酚酞指示劑：稱取酚酞1.0 g，溶于95%乙醇，并用95%乙醇稀釋至100 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 檢測波長的確定

精密吸取1.0 mg·mL-1葡萄糖標準溶液和去離子水各1.0 mL，分別加入到25 mL容量瓶中，補水至2.5 mL，各加入DNS試劑2.5 mL，混合均勻后，沸水浴加熱5 min，迅速流水冷卻，加水定容至25 mL，將葡萄糖顯色液，去離子水（空白），DNS試劑，去離子水（空白），葡萄糖顯色液，DNS試劑（空白）3組溶液，分別在波長為450 nm～600 nm范圍內(nèi)測定吸光度值。

1.2.2 顯示劑用量的確定

精密吸取1 mL葡萄糖標準溶液，分別加入到10個25 mL容量瓶中，補水至2.5 mL，分別加入0、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL、4.5 mL、5.0 mL DNS試劑，混合均勻后，沸水浴加熱5 min，迅速流水冷卻，定容至25 mL，在540 nm波長下測定吸光度值。

1.2.3 加熱時間的確定

精密吸取1 mL葡萄糖標準液，分別加入到10個25 mL容量瓶中，補水至2.5 mL，各加入2.5 mL DNS試劑，混合均勻后，分別在沸水浴中加熱1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min、10 min、15 min、20 min，迅速流水冷卻，定容至25 mL，在540 nm波長下測定吸光度值。

1.2.4 標準曲線的制作

精密吸取葡萄糖標準溶液0、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL，分別置于25 mL容量瓶中，補水至2.5 mL，加入DNS試劑2.5 mL，混合均勻后，沸水浴加熱5 min，迅速流水冷卻，定容至25 mL，在540 nm波長下測定吸光度值?？瞻渍{(diào)零，以葡萄糖含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.5 雙孢蘑菇液體搖瓶培養(yǎng)

雙孢蘑菇As2796菌種活化和液體搖瓶培養(yǎng)方法參考文獻[7]。

1.2.6 發(fā)酵液還原糖供試樣品

雙孢蘑菇經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)10 d，將不同三角瓶中發(fā)酵液和菌絲體，分別經(jīng)冷凍高速離心機（8 000 r·min-）1離心10 min，收集上清液，即得發(fā)酵液還原糖供試樣品，4℃保藏、備用。

1.2.7 發(fā)酵液總糖供試樣品

發(fā)酵液總糖供試樣品的制備參照王鵬亭等[8]方法進行改良。用移液管精密吸取發(fā)酵液5 mL，置于25 mL容量瓶中，加入5 mL的6 mol·L-1HCl溶液，封口，于消解儀中100℃加熱30 min，流水冷卻至室溫，加1滴酚酞指示劑，用6 mol·L-1NaOH溶液滴定至溶液初呈淡紅色，加水定容至25 mL，搖勻，即得發(fā)酵液總糖供試樣品。

1.2.8 樣品測定

（1） 還原糖含量的測定

精密移取步驟1.2.6所制備的還原糖供試樣品1.0 mL，于25 mL容量瓶中，定容至25 mL。然后精密移取稀釋后還原糖供試樣品溶液2.5 mL于25mL容量瓶中，加入DNS試劑2.5 mL，混勻后沸水浴加熱5 min，流水冷卻，定容至25 mL，以去離子水為空白，于540 nm處測定吸光度值，根據(jù)標準曲線，計算發(fā)酵液中還原糖的質(zhì)量。

（2） 總糖含量的測定

精密移取步驟1.2.7所制備的還原糖供試樣品5.0 mL，于50 mL容量瓶中，定容至50 mL。再精密移取稀釋后總糖供試樣品溶液1.0 mL于25 mL容量瓶中，補水至2.5 mL，加入DNS試劑2.5 mL，混勻后沸水浴加熱5 min，流水冷卻，定容至25 mL，以去離子水為空白，于540 nm處測定吸光度值，根據(jù)標準曲線，計算發(fā)酵液中總糖的質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定波長的選擇

根據(jù)文獻[9]報道，DNS法測定波長有490 nm、520 nm、540 nm等，考慮到顯色劑、紫外分光光度計相關(guān)因素的影響，為了進一步確定本研究DNS法在測定還原糖含量中的最佳波長，在波長為450 nm～600 nm范圍內(nèi)進行掃描，結(jié)果如圖1所示。

圖1 葡萄糖溶液吸收光譜Fig.1 Absorption spectrum of glucose solution

由圖1可知，葡萄糖顯色液-DNS試劑（空白）曲線最大吸收峰處的波長為490 nm，為了提高檢測的靈敏度，通常選取最大吸收峰處的波長進行測定，但從DNS試劑-水（空白）曲線可知，在490 nm波長下DNS也具有一定的吸光度值。在試驗過程中，空白和待測液中DNS的添加量相同，但顯色后部分DNS會與待測液中的還原糖發(fā)生反應(yīng)，使得測量吸光度值時，待測液中DNS含量小于空白中DNS含量，在490 nm下對測定結(jié)果造成干擾。同時，參考葡萄糖顯色液-水（空白）曲線，可知干擾現(xiàn)象在波長小于540 nm的情況下一直很顯著。故將540 nm作為本試驗確定的檢測波長。

2.2 DNS試劑用量對吸光度值的影響

在不影響吸光度值的前提下取最小體積DNS試劑為最佳用量，取不同體積的DNS試劑進行試驗，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同DNS試劑用量的吸光度值測定Fig.2 Absorption value determination with different DNS dosage

從圖2可以看出，當DNS試劑用量大于2.5 mL，吸光度值基本保持不變。因此將2.5 mL作為本試驗DNS試劑用量。

2.3 加熱時間對吸光度值的影響

葡萄糖標準液與DNS試劑分別按照不同時間在沸水浴中加熱，結(jié)果見圖3。

圖3 不同沸水浴加熱時間的吸光度值測定Fig.3 Absorption value determination with different boiling water bath time

由圖3可知，隨著沸水浴加熱時間的延長，吸光度值逐漸變大，但在5 min之后吸光度值趨于穩(wěn)定，說明DNS與還原糖的顯色反應(yīng)基本完成。因此，確定5 min為最佳沸水浴加熱時間。

2.4 標準曲線

以葡萄糖含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，如圖4所示。

圖4中的標準曲線表明，在測定范圍內(nèi)的葡萄糖含量與相應(yīng)的吸光度值之間呈良好的線性關(guān)系，顯色靈敏、穩(wěn)定，其回歸方程為：y＝0.276x-0.0043，R2＝0.9994。

2.5 方法學考察

圖4 葡萄糖標準曲線Fig.4 Standard curve of glucose

2.5.1 精確度試驗

分別取同一錐形瓶內(nèi)的發(fā)酵液還原糖、總糖供試樣品溶液，按照樣品測試方法連續(xù)測定6次，記錄吸光度值，其吸光度值如表1所示。

表1 精確度試驗結(jié)果Tab.1 Results of precision test

從表1可以看出，還原糖和總糖的相對標準偏差RSD分別為0.509%和0.684%，說明分光光度計精確度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗

分別取同一錐形瓶內(nèi)的發(fā)酵液還原糖、總糖供試樣品溶液，按樣品測定方法測定，顯色反應(yīng)完成后每隔10 min測定1次，結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Tab.2 Results of stability test

由表2可知，還原糖和總糖供試樣品在0～1 h內(nèi)吸光度值波動較小，其相對標準偏差RSD分別為0.648%和0.567%，說明發(fā)酵液還原糖、總糖供試樣品溶液經(jīng)顯色反應(yīng)后在1 h內(nèi)都是穩(wěn)定的。

2.5.3 加樣回收率試驗

3批次雙孢蘑菇發(fā)酵液按供試樣品溶液制備方法制備還原糖、總糖供試樣品溶液，精確加入無水葡萄糖對照品，按樣品測定方法分別測定各組樣品溶液加樣前后還原糖和總糖吸光度值，根據(jù)葡萄糖標準曲線，計算還原糖和總糖的含量、回收率，試驗結(jié)果見表3?；厥章剩≒）公式為：

式中：n1表示實測量；n2表示樣品量；n3表示加樣量。

表3 樣品加樣回收率試驗結(jié)果Tab.3 Results of recovery test(n＝3)

由表3可知，還原糖、總糖供試樣品溶液的平均加樣回收率分別為99.2%和100.4%，其RSD分別為0.270%和1.102%。這表明該方法中還原糖、總糖的回收性良好。

2.5.4 發(fā)酵液總糖和還原糖含量的測定

取3批次雙孢蘑菇發(fā)酵液，采用已建立的樣品測定方法，測定還原糖和總糖含量，根據(jù)葡萄糖標準曲線、還原糖樣品稀釋10倍和總糖樣品稀釋50倍，分別計算發(fā)酵液中還原糖和總糖含量，具體結(jié)果見表4。

表4 發(fā)酵液還原糖和總糖測定結(jié)果Tab.4 Results of determination of reducing sugar and total sugar content in fermentation broth

由表4可知，3批次的雙孢蘑菇發(fā)酵液還原糖含量范圍 8.42 mg·mL-1～13.82 mg·mL-1，總糖含量范圍55.00 mg·mL-1～80.50 mg·mL-1。

3 討論

本研究首次建立DNS法同時測定雙孢蘑菇發(fā)酵培養(yǎng)液還原糖和總糖含量，然而在還原糖含量的測定過程中，最佳波長的確定可能受到儀器性能、靈敏度、試驗樣品和DNS顯色劑等多種因素的影響[6]。本研究通過試驗驗證在堿性條件下DNS被還原糖還原生成的氨基化合物在490 nm波長下雖具有最大吸光度值，但在此波長下DNS也具有一定的吸光度值，對測定結(jié)果干擾嚴重，這與趙凱等[9]結(jié)論相似。通過研究DNS法測定雙孢蘑菇發(fā)酵培養(yǎng)液還原糖和總糖含量的影響因素，確定DNS試劑用量為2.5 mL，沸水浴加熱時間為5 min，檢測波長為540 nm。該方法具有方便快捷、準確、低成本等優(yōu)點，可準確測定雙孢蘑菇發(fā)酵培養(yǎng)過程中發(fā)酵液還原糖和總糖含量變化，為液體菌種的生產(chǎn)實踐提供數(shù)據(jù)支撐。