楊麗君　　孫倩　　萬曉晨

[摘要] 目的 探討結腸癌患者應用直接測序法測定K-ras基因的靈敏度及其臨床價值。 方法 選取我院2016年2月～2017年4月收治的結腸癌患者80例，隨機分為研究組和對照組兩組，研究組患者通過直接測序法、對照組患者通過sanger測序法檢測患者體內(nèi)的K-ras基因突變情況，分析K-ras基因突變率與患者腫瘤大小、腫瘤部位、患者年齡等一般資料之間的相關性。 結果 研究組患者測定K-ras基因突變的靈敏度明顯高于對照組（P<0.05），腫瘤直徑在5 cm以上患者的K-ras基因突變率明顯低于直徑在5 cm以下的患者（P<0.05），研究組檢出率與患者腫瘤部位及分化程度、患者年齡等存在相關性。 結論 應用直接測序法檢測結腸癌患者 K-ras基因的突變情況具有較高的靈敏度，直接測序法的檢出率與患者的腫瘤大小、腫瘤分化程度以及患者的年齡等存在較強的相關性，對于臨床上結腸癌等惡性腫瘤疾病的診斷具有較強的應用價值，值得臨床上廣泛推薦使用。

[關鍵詞] 結腸癌；直接測序法；K-ras基因；靈敏度；臨床價值

[中圖分類號] R446.2 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2018）16-0128-04

Sensitivity and clinical value of direct sequencing in the detection of K-ras gene in colon cancer patients

YANG Lijun SUN Qian WAN Xiaochen

Department of Clinical Laboratory， Zhejiang Hospital， Hangzhou 310013， China

[Abstract] Objective To analyze the sensitivity and clinical value of direct sequencing in the detection of K-ras gene in colon cancer patients. Methods 80 colon cancer patients from February 2016 to April 2017 in our hospital were randomLy divided into the study group and the control group. The K-ras gene mutations in the study group were detected by direct sequencing and those in the control group were detected by sanger sequencing. The correlation of the K-ras gene mutation rate with the patient's general data including tumor size， tumor location and age was analyzed. Results The sensitivity of the K-ras gene mutation detection in the study group was significantly higher than that in the control group（P<0.05）. The K-ras gene mutation rate was significantly lower in patients with tumor diameters above 5 cm than that in patients with diameters below 5 cm（P<0.05）. The detection rate of the study group is related to the location and differentiation of the patient's tumor and the age of the patient. Conclusion The direct sequencing method in the detection of the mutation of K-ras gene in patients with colon cancer has high sensitivity.The detection rate of direct sequencing is strongly correlated with the patient's tumor size， tumor differentiation，and the patient's age.The method has strong application value for the clinical diagnosis of malignant diseases such as colon cancer，and it is worth recommending.

[Key words] Colon cancer； Direct sequencing； K-ras gene； Sensitivity； Clinical value

相關研究結果表明，隨著社會的發(fā)展及人們生活水平的改變，結腸癌的發(fā)生率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，嚴重威脅患者的生命健康安全，有研究表明此類疾病的發(fā)生涉及分子水平的改變，即相關原癌、抑癌基因的改變，K-ras基因?qū)儆趓as家族的成員之一，結腸癌的發(fā)生常常伴隨其突變，隨著人類基因組計劃的完成，后基因組時代的相關技術極大程度的應用于臨床，對此我院應用直接測序法并測定其在檢測結腸癌患者體內(nèi)的K-ras基因時的靈敏度及其檢查結果與患者疾病發(fā)生情況之間的關系，取得了理想的效果，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2016年2月～2017年4月收治的結腸癌患者80例，隨機分為研究組和對照組兩組各40例，納入標準：（1）患者經(jīng)病理學檢查方法確診為結腸癌患者；（2）自愿接受本次研究的全部過程；（3）未接受過結腸切除手術，為初次發(fā)病患者[1]。排除標準：（1）兼有癲癇等精神類疾病不能積極配合者；（2）存在其他惡性腫瘤者；（3）伴有嚴重肝腎功能障礙者；（4）伴有嚴重心肺功能障礙的患者；其中研究組患者40例，男19例，女21例，年齡30～65歲，平均（46.7±2.1）歲，病程2～10個月，平均（6.3±1.5）個月，對照組患者40例，男20例，女20例，年齡31～66歲，平均（48.2±2.1）歲，病程2～12個月，平均病程（8.2±2.3）個月，兩組患者的年齡、性別差異無統(tǒng)計學統(tǒng)計學意義（P>0.05），腫瘤分化程度等差異存在統(tǒng)計學意義（P<0.05），兩組患者均知情本次研究的全部過程并簽署知情同意書，實驗過程經(jīng)本院倫理協(xié)會批準。

1.2 方法

基因組DNA的提取方法：第一，通過手術等方式切取3片病變組織，厚度為9 μm左右，切取后平鋪于潔凈的載玻片上，隨后用二甲苯進行脫蠟處理。第二，選用無菌刀片將腫瘤組織進行刮片處理并保存至2 mL左右的離心管中并加入1 mL二甲苯，充分混合后離心取上清，離心時間為120 s，將上清與1 mL無水乙醇充分混合后再離心，離心時間相同，離心結束分離沉淀并將上清置于室溫靜置以使酒精充分揮發(fā)[2]。向靜置后的血清中分別加入裂解液和蛋白酶K，用量分別為：181 μL左右、21 μL左右，混合均勻后55℃水浴60 min以使樣本徹底裂解，若60 min內(nèi)未裂解可持續(xù)進行溫水浴但時間不可超過2 d[3]。第三，裂解完成后于90℃條件下水浴60 min并立即進行離心，去除管蓋中累計的液體，重新向標本中加入裂解液 、無水乙醇，二者用量均為201 μL左右，混合均勻后立即離心并取0.6 mL的裂解產(chǎn)物置于抽提柱內(nèi)，更換提取柱所在的收集管[4]。重新加入0.5 mL裂解液，離心時間60 s后更換收集管，再次加入裂解液并離心，操作方法與用量與上步完全相同，隨后對樣品進行全速離心，去除雜質(zhì)并更換提取柱的離心管，向靠近提取柱內(nèi)膜的中心添加洗脫液并在室溫條件下放置60 s即完成試樣的提取。樣品的保存方法為：4℃保存24 h，-20℃下>1 d[5]。

1.2.1 研究組 患者K-ras基因測定方法。研究組患者采用直接測序法測定K-ras基因的突變狀況，根據(jù)結腸癌患者中K-ras基因的cDNA序列及其12、13位密碼子改變引起的7個突變的基因序列進行引物的設計，隨后分別在95℃下擴增6 min左右，同溫擴增7/12 min，溫度降低40℃后擴增45 s，溫度升至71℃后擴增1.5 min，循壞次數(shù)為35次，保存條件為4℃冷藏[6]。將擴增后的產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中電泳處理，電泳參數(shù)為120 V，25 min[7]。將335 bp左右處的克隆條帶及其膠體回收，將得到的特異性擴增產(chǎn)物送至專門公司進行測序[8]?；虻耐蛔儫晒釶CR檢測試劑盒，反應分為三個階段：（1）95℃的條件下300 s；（2）與上述相同的溫度25 s后在65℃的條件下處理20 s，溫度為73℃下處理20 s，循環(huán)次數(shù)為15次；（3）在溫度為92℃、41℃、73℃的條件下分別處理25、35、20 s，循環(huán)次數(shù)為32個左右。在第三階段的中間循壞處收集FAM和VIC信號，樣品陽性或陰性的判斷標準為突變發(fā)生的Ct值大小[9]。

1.2.2 對照組 患者K-ras基因測定方法。對照組患者采用sanger測序法測定K-ras基因的突變狀況，具體為：向反應體系中加入7種K-ra，方法同1.2.1研究組患者K-ras基因測定方法[10]。研究組患者采用直接測序法測定K-ras基因的突變狀況，根據(jù)結腸癌患者中K-ras基因的cDNA序列及其12.13位密碼子改變引起的7個突變的基因序列進行引物的設計，隨后分別在95℃下擴增6 min左右，同溫擴增7/12 min，溫度降低40℃后擴增45 s，溫度升至71℃后擴增1.5 min，循壞次數(shù)為35次，保存條件為4℃冷藏[11]。將擴增后的產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中電泳處理，電泳參數(shù)為120 V，25 min。將335 bp左右處的克隆條帶及其膠體回收，將得到的特異性擴增產(chǎn)物送至專門公司進行測序[12]。

1.3 觀察指標

（1）對比兩組研究方法的檢測靈敏度，靈敏度為真陽性/（真陽性+假陰性）。（2）對比不同組研究方法腫瘤大小與基因突變率之間的關系。（3）對比患者的腫瘤部位、患者年齡以及腫瘤分化程度與基因突變之間的關系[13]。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用統(tǒng)計學軟件SPSS19.0分析，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組研究方法靈敏度比較

研究組檢測方法的基因突變檢出靈敏度明顯高于對照組患者（P<0.05）。

2.2 兩組檢測結果與腫瘤大小之間的相關性比較

對于直徑<5 cm的腫瘤，兩組突變例數(shù)檢出率無顯著差異，對于直徑≥5 cm的腫瘤，研究組檢出率顯出高于對照組（P<0.05）。

2.3 患者一般資料與直接測序法檢測結果之間的相關性比較

直接測序法測得結果與患者的腫瘤分化程度，腫瘤部位、患者年齡之間呈明顯正相關關系（P<0.05）。

3 討論

隨著社會的發(fā)展以及人們生活水平的提高，結腸癌的疾病發(fā)生率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，統(tǒng)計結果顯示，此類疾病的發(fā)生率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，疾病的發(fā)生常常伴隨基因突變等分子水平的改變，越來越多的研究者開始在分子水平進行探究以采取合理的措施從根本上采取針對性的疾病治療措施[14]。K-ras是ras家族的重要成員，結腸癌的發(fā)生常常伴隨此類基因的突變，對此我院通過直接測序法檢測此類基因的突變情況判斷患者的疾病發(fā)生情況[15]。本次研究結果表明，隨著患者年齡的增加以及腫瘤分化程度的升高，患者體內(nèi)的基因突變率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢（P<0.05），說明直接測序法所測得的基因突變率的測定結果與患者的疾病發(fā)生情況之間存在較強的相關性，將直接測序法應用于疾病的診斷具有較強的可行性[16]。

人類基因組計劃的圓滿完成促進了后基因組時代的發(fā)展，基因組的測序以及檢測工序不斷應用于臨床，但檢測方法的準確性以及靈敏度地區(qū)差異較大，極大程度的增加了臨床靶向治療的不確定性，直接測序法基因測序技術是轉化醫(yī)學研究遺傳物質(zhì)過程中重要的技術之一[17]。研究表明通過直接測序法檢測患者體內(nèi)K-ras基因的突變情況能夠一定程度的反應患者的疾病發(fā)生情況，此類基因廣泛存在于人類的各類器官組織，參與重要的表皮生長因子的基因表達過程，與細胞分化過程密切相關[18]。本次研究結果表明，隨著患者腫瘤的不斷分化，患者的基因突變率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，說明通過直接測序法進行基因突變狀況的檢測準確性較高[19]。

相關研究結果表明，K-ras基因的主要作用機制為：借助Ras-Raf-MAPK信號通路控制細胞的增值以及分化過程，但其在正常發(fā)揮作用的過程中為調(diào)節(jié)性控制而非持續(xù)性，ras與GTP集合后才具活性，因此能夠受GTP酶的控制而失活，若GTP持續(xù)與RAS結合則引起信號通路的持續(xù)性興奮，生長信號不斷得到傳播并在傳播過程中不斷放大，最終導致細胞的持續(xù)不間斷增殖，惡性腫瘤形成。只有做到疾病的早發(fā)現(xiàn)才能及時采取針對性的措施進行早期疾病的治療。本次研究結果表明，研究組檢測的靈敏度明顯高于對照組（P<0.05），說明直接測序法的使用能夠明顯提高基因檢測的靈敏度，提高疾病的檢出效率[20]。

綜上所述，應用直接測序法檢測結腸癌患者K-ras基因的突變情況具有較高的靈敏度，直接測序法的檢出率與患者的腫瘤大小、腫瘤分化程度以及患者的年齡等存在較強的相關性，對于臨床上結腸癌等惡性腫瘤疾病的診斷具較強的應用價值，值得臨床上廣泛推薦使用。

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（收稿日期：2018-02-02）