孫倩　　楊麗君　　萬曉晨

[摘要] 目的 探討應(yīng)用離心力對(duì)質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)結(jié)腸癌患者抗原CD45的診斷價(jià)值及對(duì)其預(yù)后質(zhì)量的影響。 方法 選取2011年1月～2012年1月我院收治的結(jié)腸癌患者120例，收集結(jié)腸癌患者的結(jié)腸細(xì)胞，將收集的結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行離心，分為 400 g離心組為研究組和 140 g 離心組為對(duì)照組（每組細(xì)胞數(shù)量相同，且均為1×105個(gè)）。采用質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)兩組死亡細(xì)胞百分比、抗原CD45表達(dá)情況及活細(xì)胞中高表達(dá)CD45的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果 經(jīng)過研究分析，研究組抗原CD45表達(dá)陽(yáng)性率、抗原陽(yáng)性率低于對(duì)照組，死亡細(xì)胞百分比顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；離心前兩組患者K562殺傷比率、NK細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），離心后研究組K562殺傷比率、NK細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。 結(jié)論 對(duì)結(jié)腸癌患者在運(yùn)用質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)其抗原CD45的診斷同時(shí)應(yīng)用離心力技術(shù)，一方面能夠提高診斷價(jià)值，另一方面能夠改善患者的預(yù)后質(zhì)量，值得在臨床上進(jìn)行推廣與使用。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)腸癌；離心力；質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)；抗原CD45；診斷價(jià)值；預(yù)后質(zhì)量

[中圖分類號(hào)] R735.35 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）17-0125-03

The clinical value of mass cytometry in diagnosis for CD45 expression in patients with colon cancer

SUN Qian YANG Lijun WAN Xiaochen

Department of Laboratory， Zhejiang Hospital， Hangzhou 310013， China

[Abstract] Objective To explorethe effect of centrifugal forces on clinical valueand patients life quality of mass cytometry in diagnosis for CD45 expression incolon cancer cells. Methods 120patients with colon cancer who were treated in our hospital from January 2011 to January 2012 were selected. Their colon cells were collected and randomly divided into two groups by centrifugal forces as follows： 400 g centrifugal forces group as study group and 140 gcentrifugal forces group as control group （1×105 cells in each group）. We detected the percentage of dead cells， the expression of CD45 and the number of live cells with high expression of CD45 by mass cytometry. Results After analysis， the positive rate of antigen CD45 expression， the positive rate of antigen of the study group were lower than those of the control group， the percentage of dead cells of the study group were significantly higher than those of the control group（P<0.05）. There was no significant difference in K562 killing ratio， NK cell， B lymphocyte and T lymphocyte in two groups before centrifugal（P>0.05）. After centrifugation， K562 killing ratio， NK cell， B lymphocyte and T lymphocyte of the study group were significantly lower than those of control group（P<0.05）. Conclusion The use of mass cytometry in diagnosis for CD45 expression in patients with colon cancer can improve the value of pertinence as well as the quality of prognosis of patients， deserving clinical application and popularization.

[Key words] Colon cancer； Centrifugal forces； Mass cytometry； Antigen CD45； Diagnostic value； Quality of prognosis

醫(yī)學(xué)中所指的惡性腫瘤常被人們稱之為癌癥，臨床實(shí)踐中，結(jié)腸癌的發(fā)病率和致死率較高，是最為常見的也是對(duì)人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。結(jié)腸癌可以進(jìn)一步分為小細(xì)胞型和非小細(xì)胞型，最近幾年，我國(guó)結(jié)腸癌患者數(shù)量極速增加，據(jù)權(quán)威機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì)，年平均增長(zhǎng)速度高達(dá)27.6%[1]。結(jié)腸癌有著比較明顯的特點(diǎn)，如患病人群一般在42周歲以上；男性患者遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于女性患者，比例大約為4.5：1；發(fā)病初期癥狀不易被覺察，大部分患者被確診時(shí)已接近晚期；不宜采取外科手術(shù)方法治療，多采用介入手段，如放化療等[2]。臨床實(shí)踐中，化療方法能夠有效延緩患者生存時(shí)間，提升患者生存質(zhì)量，是較有效的治療手段。近幾年，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，流式細(xì)胞技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于癌癥的研究與治療領(lǐng)域。流式細(xì)胞包括質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)，其原理是采用同位素標(biāo)記法進(jìn)行標(biāo)記抗體，使得細(xì)胞能夠多參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，最多可以檢測(cè)數(shù)目可達(dá)50種左右[3]。雖然這幾年這種技術(shù)的使用越來越多，但是在實(shí)體腫瘤方面的應(yīng)用尚未成熟，仍是研究階段。而本文研究的CD45是一種酶受體，具體酶包括酪氨酸磷酸酶，這些酶是診斷結(jié)腸癌必備的指標(biāo)之一[4]。針對(duì)這種問題，我院選取2011年1月～2012年1月收治的結(jié)腸癌患者120例，收集結(jié)腸癌患者的結(jié)腸細(xì)胞，將收集的結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行離心，分為 400 g離心組和140 g離心組，采用質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)兩組死亡細(xì)胞百分比、抗原CD45表達(dá)情況及活細(xì)胞中高表達(dá)CD45的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)，分析結(jié)腸癌患者應(yīng)用離心力對(duì)質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)其抗原CD45的診斷價(jià)值及對(duì)其預(yù)后質(zhì)量的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月～2012年1月我院收治的非小細(xì)胞肺癌120例，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)離心后，分為 400 g離心組為研究組和140 g離心組為對(duì)照組。上述患者均已通過病理切片和影像檢查手段予以確診。納入標(biāo)準(zhǔn)[5]：經(jīng)過西醫(yī)和傳統(tǒng)的中醫(yī)診斷予以確診；年齡≥25歲；對(duì)化療無相關(guān)禁忌；KPS評(píng)分>70分；預(yù)計(jì)生存期>3個(gè)月；多發(fā)性病灶至少一個(gè)可測(cè)量；無法采取手術(shù)治療；病情屬于中晚期[3]。排除標(biāo)準(zhǔn)[6]：下列類型的患者不能參與本次研究：（1）心臟等臟器嚴(yán)重受損或者患有出血性相關(guān)病癥的患者；（2）正處于哺乳或妊娠期的女性患者；（3）已經(jīng)過手術(shù)和放療手段治療且結(jié)束時(shí)間未超過三個(gè)月的患者；（4）治療過程中出現(xiàn)感染，尚未得到控制的患者；（5）藥物性過敏體質(zhì)的患者。

對(duì)照組男47例，女13例，年齡29～73歲，平均（47.5±1.2）歲；研究組男51例，女9例，年齡31～76歲，平均（49.6±2.4）歲。兩組患者的一般資料有可比性（P>0.05），均知情同意本研究，并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱、攪拌器、質(zhì)譜流式細(xì)胞儀等。首先是細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理。選取2011年1月～2012年1月我院收治的結(jié)腸癌患者120例，收集結(jié)腸癌患者的結(jié)腸細(xì)胞，將結(jié)腸癌細(xì)胞在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)的條件為：培養(yǎng)箱要經(jīng)過嚴(yán)格消毒且對(duì)培養(yǎng)箱要進(jìn)行恒溫恒壓設(shè)定，進(jìn)出細(xì)胞間的實(shí)驗(yàn)人員要進(jìn)行消毒且培養(yǎng)箱中要放置4%多聚甲醛固定液，具體配置如下：PBS：0.1M的PBS、Nacl 1.7 g、Na2HPO4·12H2O 6.16 g、NaH2PO4·2H2O 0.56 g、雙蒸水定容至200 mL、多聚甲醛8 g、用10 mL 0.1N NaOH調(diào)解至pH 7.4左右（建議用1N的NaOH調(diào)pH），磁力攪拌器上加熱（不超過60℃）攪拌，溶解需大約4～5 h，0.1N NaOH配制：NaOH 0.02 g、雙蒸水定容至5 mL，1N NaOH配制：NaOH 0.2 g、雙蒸水定容至5 mL。之后選擇生長(zhǎng)期處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌細(xì)胞，采取消化酶（胰酶），進(jìn)行消化后分為兩組：400 g離心力組與140 g離心力組進(jìn)行離心。對(duì)于400 g離心力組：首先對(duì)消化后的細(xì)胞進(jìn)行PBS洗滌，之后細(xì)胞采用 400 g離心力，進(jìn)行離心5 min，重復(fù)離心3次后，舍去上清，取沉淀。對(duì)于140 g離心力組：首先對(duì)消化后的細(xì)胞進(jìn)行PBS洗滌，之后細(xì)胞采用140 g離心力，進(jìn)行離心5 min，重復(fù)離心3次后，舍去上清，取沉淀。兩組沉淀細(xì)胞在流式細(xì)胞儀中進(jìn)行檢查。將兩組細(xì)胞分別放入試管中，分別加入甲醇進(jìn)行固定，固定半小時(shí)后進(jìn)行染色，往試管中加入染色緩沖液，先混勻再靜止放置半小時(shí)待充分染色均勻后進(jìn)行離心。離心后取沉淀，往沉淀中加入PBS緩沖液后，啟動(dòng)質(zhì)譜流式細(xì)胞儀，對(duì)細(xì)胞表達(dá)情況進(jìn)行分析。

1.3 療效判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 不同離心力組死亡細(xì)胞對(duì)比 對(duì)研究組與對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行離心后，采用質(zhì)譜流式細(xì)胞儀，對(duì)活細(xì)胞以及死亡細(xì)胞進(jìn)行分析，并統(tǒng)計(jì)死亡細(xì)胞百分比。使用儀器軟件GraphPad Prism統(tǒng)計(jì)軟件。

1.3.2 不同離心力組抗原CD45表達(dá)情況 檢查儀器主要是質(zhì)譜流式細(xì)胞儀，檢查兩組細(xì)胞的抗原CD45表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)比。若患者抗原CD45表達(dá)則為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為抗原CD45表達(dá)的細(xì)胞比總細(xì)胞比值。

1.3.3 不同離心力組患者免疫學(xué)指標(biāo)對(duì)比 化學(xué)免疫分析法（CMIA）采用美國(guó)雅培ARCHI-TECTi2000及其配套試劑產(chǎn)品，根據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作，步驟主要包括加樣、孵育、洗板、加酶、比色等。設(shè)計(jì)好標(biāo)本位置、檢測(cè)項(xiàng)目，按開始鍵即可。患者進(jìn)行抽血檢驗(yàn)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)判斷細(xì)胞內(nèi)K562含量以及NK細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，以確定患者各類細(xì)胞如B/T淋巴細(xì)胞的被殺傷比率[7]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS18.0進(jìn)行分析，其中計(jì)數(shù)資料以（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢測(cè)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組抗原CD45表達(dá)情況比較

經(jīng)分析，研究組抗原CD45表達(dá)陽(yáng)性率、抗原陽(yáng)性率皆低于對(duì)照組，而死亡細(xì)胞百分比情況顯著高于對(duì)照組（P<0.05）

2.2 兩組離心前后免疫學(xué)指標(biāo)比較

離心前兩組患者K562殺傷比率、NK細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞對(duì)比無明顯區(qū)別（P>0.05），離心后研究組K562殺傷比率、NK細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞顯著低于對(duì)照組（P<0.05）

3討論

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，科技水平也在不斷發(fā)展。一些科學(xué)技術(shù)也在不斷應(yīng)用于醫(yī)療技術(shù)之中。近年來，隨著分子生物學(xué)迅猛發(fā)展，對(duì)于人體細(xì)胞水平的研究在不斷進(jìn)行之中[8]。而質(zhì)譜流式細(xì)胞儀技術(shù)的誕生大大幫助了人們對(duì)細(xì)胞的研究。質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)是將質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)與傳統(tǒng)流式細(xì)胞技術(shù)相結(jié)合，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行跟蹤分析。臨床實(shí)踐中，化療方法能夠有效延緩患者生存時(shí)間，提升患者生存質(zhì)量，是較有效的治療手段[9]。近幾年，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，流式細(xì)胞技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于癌癥的研究與治療領(lǐng)域。流式細(xì)胞包括質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)，其原理是采用同位素標(biāo)記法進(jìn)行標(biāo)記抗體，使得細(xì)胞能夠多參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，最多可以檢測(cè)數(shù)目可達(dá)50種左右。雖然這幾年這種技術(shù)的使用越來越多，但是在實(shí)體腫瘤方面的應(yīng)用尚未成熟，仍是研究階段[10]。

本文研究中，在進(jìn)行質(zhì)譜流式細(xì)胞檢測(cè)前，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的加工也就是細(xì)胞的離心純化[11]。通過選擇不同的離心力，將細(xì)胞進(jìn)行分類，在本文選擇的離心力分為兩組一種為140 g、一種是400 g。且進(jìn)行離心時(shí)注意離心力的選擇，要適當(dāng)，不能選擇過大或者過小。因?yàn)檫^大時(shí)，部分細(xì)胞會(huì)破裂、震碎[12]。離心力過小時(shí)，一些雜質(zhì)分離不出，使得檢測(cè)結(jié)果有誤差。我院所采取的對(duì)照試驗(yàn)表明，400 g離心力組抗原CD45表達(dá)情況顯著高于140 g離心組（P<0.05）。

本文研究的CD45是一種抗原，在臨床上它的別稱為白細(xì)胞共同抗原，這種抗原在白細(xì)胞中均進(jìn)行表達(dá)，并且臨床研究顯示，CD45的表達(dá)含量與淋巴細(xì)胞的活化程度密切相關(guān)[13]，且隨著結(jié)腸癌病發(fā)程度越大，其表達(dá)量越低。而在臨床實(shí)踐中，一般對(duì)惡性腫瘤特別是晚期惡性腫瘤治療采用傳統(tǒng)化療方案副作用大、效果差，因此，臨床上從細(xì)胞角度進(jìn)行分析，找出更加簡(jiǎn)單的治療方法，緩解患者痛苦，延緩患者生命[14]。臨床用于治療癌癥，原理一般為：（1）能夠有效控制腫瘤的產(chǎn)生和增長(zhǎng)，將腫瘤發(fā)展控制在初期，進(jìn)而致使癌細(xì)胞死亡[15]；（2）能夠有效控制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，對(duì)于惡性腫瘤發(fā)展具有明顯的阻礙作用，遲滯腫瘤生成，以此實(shí)現(xiàn)阻礙腫瘤生成和擴(kuò)散的的目的[16]；（3）提高人體免疫功能，可以提高細(xì)胞活力，破壞惡性腫瘤細(xì)胞的生成，全面提升患者免疫能力[17]；（4）減輕化療副作用，使蛋白含量和基因功能方面加強(qiáng)人體有效因子的產(chǎn)生，增強(qiáng)細(xì)胞功能，提升患者白細(xì)胞數(shù)量；（5）明顯改善患者消化道功能，增強(qiáng)胃壁厚度，以此降低患者不良反應(yīng)[18-20]。本文研究發(fā)現(xiàn)，離心前患者免疫學(xué)指標(biāo)對(duì)比無明顯區(qū)別（P>0.05），離心后研究組免疫學(xué)指標(biāo)顯著優(yōu)于對(duì)照組（P<0.05）。

綜上所述，對(duì)結(jié)腸癌患者在運(yùn)用質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)其抗原CD45的診斷同時(shí)應(yīng)用離心力技術(shù)，一方面能夠提高診斷價(jià)值，另一方面能夠改善患者的預(yù)后質(zhì)量，值得在臨床上進(jìn)行推廣與使用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 姜霞，翟從劼，張峰，等. 離心力對(duì)質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞表面抗原CD45表達(dá)結(jié)果的影響[J]. 山東醫(yī)藥，2017，57（24）：13-15.

[2] 馮文磊，張猛，印雙紅，等. 改良差時(shí)貼壁法分離培養(yǎng)鑒定小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮前體細(xì)胞[J]. 解剖學(xué)報(bào)，2015，46（2）：282-288.

[3] 李艷榮，郭蓮怡. 潰瘍性結(jié)腸炎患者外周血T細(xì)胞表面CD4+CD45+分子表達(dá)的變化及臨床意義[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，36（2）：127-129.

[4] 周琰，李琴，劉皋林，等. 臨床（前）研究的質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)——流式細(xì)胞技術(shù)的“后熒光時(shí)代”[J]. 中國(guó)新藥與臨床雜志，2017，34（1）：1-6.

[5] 王寧方，趙崇山，李娟，等. 乳腺癌患者CD45-微泡和單個(gè)核細(xì)胞的特性及其臨床意義[J]. 腫瘤，2016，36（6）：674-682.

[6] 陳建安，周靜，朱學(xué)海，等. 118例急性白血病五色流式細(xì)胞術(shù)免疫分型與FAB分型的結(jié)果分析[J]. 海南醫(yī)學(xué)，2015，13（1）：56-59.

[7] 張子杰. 結(jié)腸癌組織VEGF表達(dá)與樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)的臨床意義及與血清VEGF濃度及其活化水平的相關(guān)性[J]. 中國(guó)免疫學(xué)雜志，2015，14（9）：1257-1261.

[8] Wu XL，Tu Q，F(xiàn)aure G，et al. Diagnostic and Prognostic Value of Circulating Tumor Cells in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma：A systematic review and meta-analysis[J]. Scientific Reports，2016，26（23）：202-210.

[9] 呂學(xué)文，王博，李揚(yáng)秋. CHOP方案治療前后外周T細(xì)胞淋巴瘤患者外周血 CD45 RA+T 和CD45 RO+T的變化特點(diǎn)[J]. 中國(guó)免疫學(xué)雜志，2015，24（4）：531-533.

[10] 汪宏梅，張?jiān)茖帲_云. 流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)急性髓細(xì)胞白血病患者外周血淋巴細(xì)胞亞群的效果分析[J]. 實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2017，21（21）：36-38.

[11] 王繼英，劉燕，宋振，等. 急性B淋巴細(xì)胞白血病患者初發(fā)和化療后微量殘留白血病細(xì)胞免疫表型的比較[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2016，31（6）：467-473.

[12] 張菊英，張亞衡. 免疫磁珠陽(yáng)性篩選聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)對(duì)胰腺癌外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的診斷價(jià)值[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2016，20（4）：551-554.

[13] 楊志瑞，朱海燕，達(dá)萬明，等. 急性移植物抗宿主病患者外周血中T細(xì)胞功能亞群的變化及臨床意義[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2015，23（1）：190-194.

[14] 張小芳，孫彩霞，張運(yùn)剛，等. 急性白血病患者骨髓細(xì)胞形態(tài)和免疫表型同步檢測(cè)的比較分析[J]. 國(guó)際免疫學(xué)雜志，2016，39（5）：442-445.

[15] 唐潔，蔣能剛，梁效功，等. 四色十抗體流式免疫表型分析方案在多發(fā)性骨髓瘤診斷中的價(jià)值[J]. 華西醫(yī)學(xué)，2017，23（3）：419-424.

[16] Arana P，Paiva B，Cedena MT，et al. Prognostic value of antigen expression in multiple myeloma：A PETHEMA/GEM study on 1265 patients enrolled in four consecutive clinical trials[J]. Leukemia，2017，13（14）：133-140.

[17] 賀繼剛， 李洪榮， 桂龍升，等. 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞SCA-1+/CD45+/CD31+亞群自身抗凋亡基因研究[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，50（12）：1757-1761.

[18] 馮婷婷，甘建和，吳南屏，等. AIDS患者HAART治療免疫重建過程中檢測(cè)CD4+CD45RO+/CD45RA+CD127+T細(xì)胞的意義及其相關(guān)免疫調(diào)節(jié)分析[J]. 江蘇醫(yī)藥， 2016，42（1）：12-16.

[19] 嚴(yán)艷，婁金麗，禇蓓. 不同試劑在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)CD45+、CD4+細(xì)胞的效果評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2015，24（22）：3871-3874.

[20] Wang L，Zhai ZW，Ji DB，et al. Prognostic value of CD45RO（+） tumor-infiltrating lymphocytes for locally advanced rectal cancer following 30 Gy/10f neoadjuvant radiotherapy[J]. International Journal of Colorectal Disease，2015，30（6）：734-753.

（收稿日期：2018-02-09）