黃麗波，張秀霞，范曉杰，侯衍猛，姜淑貞，魯 璇, 袁學(xué)軍

(1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省畜禽疫病防制工程技術(shù)研究中心，泰安 271018； 2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，濟(jì)南250014； 3. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安 271018)

肥大細(xì)胞(mast cell，MC)是一種包含異嗜顆粒的多功能免疫活性細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞[1]，能分泌和釋放幾十種介質(zhì)和細(xì)胞因子,包括組織胺、蛋白酶、炎性因子等[2]，在多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。肥大細(xì)胞在體內(nèi)廣泛分布，子宮中肥大細(xì)胞在發(fā)情周期、著床、妊娠和分娩過程中具有重要作用[3]，子宮中肥大細(xì)胞數(shù)量和組織胺水平與發(fā)情周期中子宮內(nèi)免疫水平密切相關(guān)[4]，肥大細(xì)胞比T細(xì)胞更能代表子宮免疫水平[5]。

胚胎著床是由神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)共同參與的復(fù)雜的生理過程，包括胚泡定位、附著和滋養(yǎng)層浸潤(rùn)[6]。胚胎著床中滋養(yǎng)層浸潤(rùn)是一個(gè)可控的炎癥反應(yīng)，在著床前需要在子宮內(nèi)膜局部炎性擴(kuò)張，在附著浸潤(rùn)后又要降低免疫水平避免免疫排斥。在圍著床期大鼠子宮內(nèi)組織胺濃度升高，增加了子宮血管的通透性，為著床做好準(zhǔn)備[7]。組織胺是胚胎著床所需的炎性介質(zhì)。來(lái)源于胚胎的組織胺釋放因子可誘導(dǎo)子宮肥大細(xì)胞釋放組織胺，作用到囊胚的組織胺受體上而啟動(dòng)著床[7]，防止母體的免疫排斥[8]。組織胺通過H1受體抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡[9-10]，進(jìn)而影響滋養(yǎng)層細(xì)胞分化[11]和浸潤(rùn)。子宮內(nèi)組織胺可來(lái)源于肥大細(xì)胞[12]和子宮上皮細(xì)胞[13]；子宮上皮細(xì)胞內(nèi)組織胺通過組氨酸脫羧酶轉(zhuǎn)化生成[13]。肥大細(xì)胞可以存儲(chǔ)已合成的組織胺，當(dāng)細(xì)胞活化后釋放。

孕前切除支配子宮的植物性神經(jīng)導(dǎo)致的大鼠胚胎著床抑制或延遲，并且與孕5 d子宮中肥大細(xì)胞數(shù)目增加及組織胺的釋放密切相關(guān)[14]。但是在著床前、后肥大細(xì)胞和組織胺的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律還不清楚。本研究通過切除植物性神經(jīng)，觀察神經(jīng)對(duì)胚胎著床影響、檢測(cè)著床前后子宮中肥大細(xì)胞數(shù)量和組織胺的含量變化，從而揭示植物性神經(jīng)對(duì)著床和子宮局部細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選擇健康的性成熟Wistar雌性大鼠為試驗(yàn)動(dòng)物(購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，180日齡，采取自繁自養(yǎng)的模式建立試驗(yàn)所需的雌鼠90只，體重為300～350 g，自由采食、飲水，在恒溫條件下進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將90只雌性性成熟大鼠隨機(jī)分為對(duì)照、假手術(shù)和手術(shù)處理(n=30)3組，組間初始體重差異不顯著(P>0.05)。假手術(shù)處理組大鼠在腹壁切下一塊脂肪；手術(shù)組大鼠先進(jìn)行手術(shù)切除支配子宮的植物性神經(jīng)(腸系膜后神經(jīng)節(jié)節(jié)后纖維和盆神經(jīng)叢節(jié)前纖維)，20 d后，傷口愈合，開始試驗(yàn)。各組內(nèi)再分為妊娠4、5、6 d 3組(n=10)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 樣本采集 待大鼠妊娠4、5、6 d，將其麻醉致死，剖腹迅速取出卵巢、子宮，稱重，觀察排卵、著床情況，并采集子宮樣品，加入臺(tái)氏液，用于肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)和組織胺含量分析。

1.3.2 肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)和組織胺含量分析 子宮稱重，置臺(tái)氏液中剪碎，用胰酶(濃度：1 mg·mL-1，加10 mg·g-1子宮重的胰酶)消化，放入CO2培養(yǎng)箱(37 ℃， 5%的CO2)消化1 h，150目細(xì)胞篩過濾，2 700 r·min-1離心5 min，棄上清，加入含BSA的臺(tái)氏液3～5 mL，2 700 r·min-1離心5 min，棄上清，留沉淀加入2 mL臺(tái)氏液，混勻后進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)。用臺(tái)氏液稀釋細(xì)胞液按(5～10)×105·mL-1分裝，一部分3 068 r·min-1離心8 min，取上清，用于測(cè)肥大細(xì)胞自發(fā)釋放組織胺的量。另一部分煮沸10 min，再離心，取上清，測(cè)子宮組織胺總含量。組織胺含量檢測(cè)按照rat histamine ELISA檢測(cè)試劑盒(CSB:E07862r，購(gòu)自CASABIO

公司)說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析相關(guān)數(shù)據(jù)，試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠子宮著床點(diǎn)和卵巢排卵點(diǎn)數(shù)量

切除植物性神經(jīng)后，大鼠子宮內(nèi)著床點(diǎn)明顯減少，而卵巢排卵點(diǎn)無(wú)明顯變化。卵巢的排卵點(diǎn)數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表1)顯示，雙側(cè)排卵點(diǎn)基本維持在14～16個(gè)，切除植物性神經(jīng)后無(wú)顯著變化(P>0.05)，表明植物性神經(jīng)對(duì)卵巢排卵無(wú)顯著影響。

對(duì)照組大鼠在妊娠4 d時(shí)基本觀察不到著床點(diǎn)，因?yàn)榇笫笈咛ブ查_啟是在妊娠第5天，可以看到略微突起的著床點(diǎn)。對(duì)照組和假手術(shù)組子宮的著床點(diǎn)同一時(shí)期差異不顯著(P>0.05)。切除植物性神經(jīng)對(duì)大鼠著床點(diǎn)的影響較為強(qiáng)烈，手術(shù)組在妊娠5、 6 d著床點(diǎn)很少或觀察不到，僅個(gè)別鼠有少數(shù)胚胎著床，與對(duì)照組和假手術(shù)組比均差異極顯著(P<0.01)(表1)。

表1切除植物性神經(jīng)后大鼠子宮著床點(diǎn)和卵巢排卵點(diǎn)數(shù)

Table1Consequenceofuterineautonomicnerveamputationonthenumberofimplantationsitesandovulatedsites

組別Group著床點(diǎn) No.of implantation排卵點(diǎn)No.of ovulationd4d5d6d4d5d6對(duì)照組Control0.00±0.0012.00±1.7312.0±1.8314.00±2.0014.50±0.5815.25±1.71手術(shù)組Operation0.00±0.000.80±1.40??0.67±1.15??15.67±1.5314.00±1.7314.00±1.83假手術(shù)組Sham operation0.00±0.0011.00±2.0013.00±1.7313.75±1.7114.75±1.7115.00±1.41

表內(nèi)同一列數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性比較，*.P<0.05；**.P<0.01

Difference significance is compared in the same column in the table,*.P<0.05；**.P<0.01

2.2 大鼠子宮組織胺含量的檢測(cè)

ELISA檢測(cè)子宮組織中組織胺含量，結(jié)果表明：對(duì)照組大鼠子宮自發(fā)釋放組織胺含量表現(xiàn)為在妊娠4、6 d高，5 d最少的波動(dòng)變化(表2)。子宮可釋放的組織胺總量在妊娠4 d最高，到妊娠5 d明顯降低(P<0.05)，妊娠6 d略有升高(表2)。這說(shuō)明在著床前子宮自發(fā)釋放組織胺量和可釋放總量處于較高水平，為胚胎著床提供微環(huán)境。假手術(shù)組變化趨勢(shì)同對(duì)照組基本一致。

切除支配子宮的植物性神經(jīng)后，雖然子宮自發(fā)釋放組織胺量在妊娠4～6 d表現(xiàn)出與正常對(duì)照一致的波動(dòng)變化(表2)，但同期數(shù)值明顯下降，尤其是在妊娠4、6 d差異顯著，在妊娠4 d由(13.75±0.67) pg·g-1子宮重降至(8.12±1.51)pg·g-1子宮重，在妊娠6 d由(16.56±1.19) pg·g-1-子宮重降至(8.84±0.83) pg·g-1子宮重(P<0.05)。子宮可釋放組織胺的總量在妊娠4 d極顯著降低(P<0.01)，由對(duì)照組的(43.04±2.99) pg·g-1子宮重降至(20.32±3.17) pg·g-1子宮重(P<0.001)；在妊娠5、6 d數(shù)值與對(duì)照相近(表2)。這說(shuō)明植物性神經(jīng)可影響著床前子宮內(nèi)釋放組織胺。

2.3 圍著床期大鼠MC數(shù)量統(tǒng)計(jì)

子宮組織經(jīng)酶消化細(xì)胞染色后獲得肥大細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。結(jié)果表明，對(duì)照組妊娠4、6 d大鼠子宮肥大細(xì)胞數(shù)量較高，在妊娠5 d數(shù)量最少，為6.57×106·g-1子宮重，與妊娠4、6 d相比差異顯著(P<0.05)。切除支配子宮的植物性神經(jīng)后，手術(shù)組的肥大細(xì)胞數(shù)量在妊娠4～6 d表現(xiàn)為不同于對(duì)照組，在妊娠4 d顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，妊娠5 d肥大細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組同期水平(P<0.05)， 到妊娠6 d還低于對(duì)照組同期數(shù)量(表3)。切除神經(jīng)后，手術(shù)組的子宮肥大細(xì)胞數(shù)在妊娠4～6 d的變化與子宮組織胺總含量變化呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)(表2、3)。5～6 d假手術(shù)組結(jié)果同對(duì)照組基本一致，差異不顯著(表3)。

表2圍著床期子宮組織胺含量變化

Table2Thechangesinhistaminecontentinuterusduringperi-implantation

pg·g-1

組間數(shù)據(jù)差異顯著性比較用*表示，*.P<0.05；**.P<0.01；組內(nèi)數(shù)據(jù)差異顯著性比較用不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同

Difference significance in data between groups is expressed in signal “*”, *.P<0.05；**.P<0.01; Difference significance of data in group is expressed in different superscript letters(P<0.05).The same as below

表3圍著床期大鼠子宮肥大細(xì)胞的數(shù)量

Table3Thenumberofmastcellinratuterusduringperi-implantation

(×106·g-1)

3 討 論

3.1 植物性神經(jīng)影響胚胎著床與子宮中肥大細(xì)胞的關(guān)系

本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在妊娠4～6 d，子宮中肥大細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)明顯波動(dòng)，而且切除植物性神經(jīng)后，數(shù)量發(fā)生明顯變化，同時(shí)胚胎著床出現(xiàn)延遲和減少，提示，在著床窗口期，肥大細(xì)胞數(shù)量的顯著改變可能與胚胎著床關(guān)系密切，且與支配子宮的植物性神經(jīng)有關(guān)。這一結(jié)果與筆者前期工作結(jié)果[14]是一致的。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，子宮中肥大細(xì)胞在妊娠4 d有一個(gè)高峰。肥大細(xì)胞作為免疫功能和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞[15-16]，可釋放炎性介質(zhì)，引起局部黏膜血管擴(kuò)張，有利于炎性細(xì)胞的募集，肥大細(xì)胞還可以釋放趨化因子[17]、TNF-α[18]、IL[19]等炎性介質(zhì)募集血液中白細(xì)胞、免疫細(xì)胞到子宮內(nèi)膜，維持子宮內(nèi)膜局部著床所需的免疫環(huán)境。到妊娠5 d子宮肥大細(xì)胞數(shù)量明顯降下來(lái)，可以避免過度的免疫刺激，與其他免疫細(xì)胞一起參與胎母界面免疫耐受[20]。而切除植物性神經(jīng)后，肥大細(xì)胞在妊娠4 d明顯低于正常，不足以刺激局部炎癥反應(yīng)，不利于胚囊附著和浸潤(rùn)，而妊娠5 d時(shí)，肥大細(xì)胞數(shù)量又明顯高于正常，可能會(huì)引起免疫排斥，導(dǎo)致著床延遲或不能著床。

關(guān)于肥大細(xì)胞在胚胎著床中的作用，文獻(xiàn)報(bào)道中存有爭(zhēng)議，Salamonsen等[21]、Menzies等[22]報(bào)道認(rèn)為肥大細(xì)胞在鼠類胚胎著床中不起作用。Salamonsen等[21]發(fā)現(xiàn)，在妊娠7 d大鼠子宮內(nèi)著床點(diǎn)與非著床點(diǎn)之間肥大細(xì)胞數(shù)量沒有變化，而且肥大細(xì)胞主要分布在子宮肌層；而小鼠研究結(jié)果證實(shí)，在孕1～8 d 小鼠子宮內(nèi)著床點(diǎn)附近蛻膜內(nèi)沒有肥大細(xì)胞，因而認(rèn)為肥大細(xì)胞對(duì)著床不起作用[13]。但是檢測(cè)肥大細(xì)胞時(shí)間已過了大、小鼠胚胎著床窗口期(4～5 d)， 其結(jié)論有待進(jìn)一步驗(yàn)證。Menzies等[22]發(fā)現(xiàn),用肥大細(xì)胞缺陷小鼠(C57BL/6J-KitW-sh/W-sh，表現(xiàn)為c-Kit限制性基因表達(dá))同源交配后產(chǎn)生的后代，與野生型后代在初生重和胎母界面指數(shù)無(wú)明顯差別，由此也認(rèn)為肥大細(xì)胞對(duì)著床影響不大。但同源雜交本身就有遺傳穩(wěn)定性的問題，Woidacki等[23]用同樣的基因鼠(C57BL/6J-KitW-sh/W-sh)發(fā)現(xiàn)通過異源交配后胚囊著床明顯減少，而移植野生型的小鼠肥大細(xì)胞后可正常著床。Treg誘導(dǎo)出現(xiàn)小鼠胎母界面免疫耐受后肥大細(xì)胞相關(guān)基因(Thp1、Mcpt1和Mcpt5)表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，提示肥大細(xì)胞可能參與胎母界面免疫耐受[20]。而且肥大細(xì)胞對(duì)著床期間組織重構(gòu)，以及后來(lái)胎盤和胎兒生長(zhǎng)都有重要作用[24]。

3.2 植物性神經(jīng)影響胚胎著床與組織胺釋放的關(guān)系

切除支配子宮的植物性神經(jīng)可以延遲或減少胚胎著床，并且明顯改變了大鼠妊娠4～6 d子宮內(nèi)組織胺水平，推測(cè)植物性神經(jīng)影響胚胎著床可能是通過組織胺釋放改變了子宮免疫水平和胚胎著床所需的微環(huán)境來(lái)實(shí)現(xiàn)的[14]。因?yàn)檎Ｇ闆r下，妊娠4 d組織胺水平有一高峰，組織胺可使子宮內(nèi)膜局部腫脹，利于胚泡浸潤(rùn)和侵入，維持著床所需微環(huán)境，這一結(jié)果與Paria等[13]相關(guān)報(bào)道是一致的。而切除植物性神經(jīng)后，組織胺水平在妊娠4 d明顯低于正常，不足以刺激局部炎癥反應(yīng)，不利于胚囊附著和浸潤(rùn)，導(dǎo)致著床延遲或不能。

關(guān)于肥大細(xì)胞與組織胺的關(guān)系，組織胺是肥大細(xì)胞的一種主要組成的活性介質(zhì)[25],有報(bào)道證實(shí)小鼠子宮肥大細(xì)胞數(shù)量與組織胺濃度變化是平行的[26]，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，正常妊娠大鼠4～6 d子宮中自發(fā)釋放組織胺含量與肥大細(xì)胞數(shù)量的變化趨勢(shì)基本一致，這表明在妊娠4～6 d，子宮局部胚胎著床微環(huán)境中組織胺水平與肥大細(xì)胞活化密切相關(guān)。肥大細(xì)胞組織學(xué)方面的證據(jù)也支持這一推論，在系膜三角區(qū)有大量肥大細(xì)胞可直接釋放組織胺經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)子宮內(nèi)膜，因?yàn)樽訉m的所有血管和神經(jīng)支配都經(jīng)過系膜進(jìn)入子宮內(nèi)部[27]。切除植物性神經(jīng)后,妊娠4～6 d大鼠子宮中組織胺可釋放量與肥大細(xì)胞數(shù)量的變化趨勢(shì)基本一致，尤其在妊娠4 d，子宮組織胺總濃度與肥大細(xì)胞數(shù)量一樣都顯著低于正常水平。這一結(jié)果說(shuō)明植物性神經(jīng)可以調(diào)節(jié)子宮內(nèi)組織胺的釋放，在妊娠4 d大鼠子宮中肥大細(xì)胞是神經(jīng)影響組織胺釋放的主要來(lái)源，或者說(shuō)神經(jīng)可通過肥大細(xì)胞影響組織胺釋放的。這和筆者前期的體外試驗(yàn)證明大鼠子宮肥大細(xì)胞組織胺的釋放能夠被神經(jīng)肽SP調(diào)節(jié)的報(bào)道[14]是相吻合的。在皮膚和腸道組織已發(fā)現(xiàn)神經(jīng)-肥大細(xì)胞形態(tài)功能聯(lián)系，植物性神經(jīng)可調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞功能[28-29]。但是在子宮內(nèi)還未見有類似的資料報(bào)道。已有的研究資料表明子宮中肥大細(xì)胞組織胺的釋放受生殖激素影響[26,30]，那么本試驗(yàn)結(jié)果中神經(jīng)對(duì)組織胺釋放的影響是通過神經(jīng)的直接作用，還是間接作用還有待于進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，大鼠子宮中肥大細(xì)胞和組織胺含量在妊娠4～6 d呈現(xiàn)波動(dòng)變化，這種變化對(duì)維持胚胎著床所需的免疫環(huán)境有重要作用。支配子宮的植物性神經(jīng)可調(diào)節(jié)著床期子宮中肥大細(xì)胞數(shù)量和組織胺釋放，改變子宮局部免疫水平和微環(huán)境，參與胚胎著床調(diào)控。

致謝：感謝山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2010CM052)，山東省教育廳高等學(xué)校科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(J11LC26)和山東省“雙一流”獎(jiǎng)補(bǔ)資金對(duì)本研究的經(jīng)費(fèi)支持。